2019-10-14 18:22:07 热度:

全基因组测序探究与脑膜炎相关的侵入性肺炎球菌突变

革兰氏阳性菌肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)经常定植在人的咽部,通常会侵入无菌的身体部位引起侵入性肺炎球菌病(IPD),包括菌血症、菌血症性肺炎、脑膜炎。IPD是世界范围内发病和死亡的主要原因,而肺炎球菌性脑膜炎是IPD中更为严重的一种,具有高的死亡和永久性神经后遗症风险。肺炎链球菌的突变有时会引起脑膜炎,增加对脑膜炎相关的肺炎链球菌突变的了解,可以提高人们对发病机制的理解,并为预防策略提供信息。本文报告了IPD病人测试队列(n=2054)、独立的验证队列(n=2518)中,肺炎链球菌pbp1b基因突变(pbp1bA641C突变引起PBP1b转糖基酶结构域N214T突变)与脑膜炎的发生有关。感染pbp1bA641C突变型肺炎链球菌的病人得脑膜炎的概率是感染非pbp1bA641C突变型肺炎链球菌的病人的2.8倍。pbp1bA641C的突变导致抗生素治疗杀死细菌需要更长的时间。因此,在IPD患者中,肺炎球菌突变导致抗生素耐受性增加与脑膜炎有关。

文献ID

题目:侵入性肺炎链球菌的基因组关联分析确定了一种与脑膜炎相关的错义突变

译文:Genome-wideassociationanalysesofinvasivepneumococcalisolatesidentifyamissensebacterialmutationassociatedwithmeningitis

期刊名:NatureCommunications

年份:2019   IF:11.878

通讯作者:YuanLi

单位:国家免疫和呼吸疾病中心,疾病控制和预防中心,美国

 

 

材料与方法

测序方法:Illumina全基因组测序

测序深度中位值:测试队列:212×  验证队列:104×

 

 

研究成果

1、测试队列概况

测试队列分离株可以广泛地代表监测地区从1999年到2013年肺炎链球菌的基因组多样性,139(6.8%)个分离株来自脑膜炎患者,1915(93.2%)个分离株来自非脑膜炎的IPD病人(表1)。与其他年龄相比,<2和5-17岁IPD的患者有较高频率的脑膜炎。包括7种血清型的七价肺炎球菌结合疫苗(PCV7)以及包括额外6种血清型的十三价肺炎球菌结合疫苗(PCV13)组比非PCV13组脑膜炎发生率低。脑膜炎病例与样本年份或青霉素敏感性均无关。

 

表1测试队列中侵入性肺炎球菌的特征

 

表2验证队列中侵入性肺炎球菌分离株的分析

 

测试队列分离株的全基因组测序和重头组装鉴定出7,480个CDS序列的同义突变SNP,以及10,584个CDS序列的能引起氨基酸改变(AAVs)的非同义突变SNP,1885个基因存在缺失或变异(GAPs)。所有的AAVs和GAPs(n=12469)采用线性混合效应模型(LMM)评估与脑膜炎的关系(图1a)。模型用FaST-LMM软件进行拟合,鉴定了P值最低的AAV作为候选变异(P=6.8×10–6,图1b),通过Bonferroni校正后P值为0.08。第二低的P值(P=2.2×10–4)是候选变异的31倍,且Bonferroni校正后不显著。使用GEMMA软件也得到相同的结果。候选变异(pbp1b641C)使pbp1b基因序列(SP_2099)641位从A变成C,从而青霉素结合蛋白(PBP)1B的转糖基酶结构域从天冬氨酸N变异成苏氨酸T。在测试队列,16.5%(23)脑膜炎病人和6.4%(122)的非脑膜炎病人受pbp1b641C型肺炎球菌感染。在1909个非pbp1b641C型分离株中,pbp1b的614位点98%(1876)是A,2%(33)缺失。

 

pbp1b基因在20个肺炎球菌参考基因组中是保守的,两侧始终分别是一个假设的蛋白基因(SP_2098)和酪氨酸tRNA合成酶基因(tyrS)(图1c)。邻近位点的变异与脑膜炎无显著相关性,与候选变异的连锁不平衡程度较低(图1d)。

 

图1测试队列肺炎球菌变异与脑膜炎的关系

 

2、验证队列

验证队列包括2015年1月1日至12月31日期间活菌监测中心(ABCs)IPD病例中所有可用的侵入性分离株(n=2518),占十个监测点IPD病例中的85.6%。脑膜炎分离株的比例(7.1%)与测试队列相似。验证队列患者以成人(≥18岁)为主,以感染非PVC血清型肺炎球菌为主(图2a)。年龄和血清型分布显示了当前IPD流行病学,与测试样本中观察到的结果有很大不同,说明该队列是独立的。

 

验证队列的研究主要目的是评估pbp1b641C是否与IPD患者更高的脑膜炎概率有关,次要目标包括:(1)鉴定其他的候选变异,(2)量化不同亚组中与pbp1b641C相关的脑膜炎风险增加,(3)描述pbp1b641C基因型在人群中的分布。

 

验证队列分离株的全基因组测序和重头组装鉴定出16,047个CDS序列的同义突变SNP,以及17,636个CDS序列的能引起氨基酸改变(AAVs)的非同义突变SNP,1768个基因存在缺失或变异(GAPs)。所有的AAVs和GAPs(n=19,404)采用LMM评估与脑膜炎的关系(图2b)。模型用FaST-LMM软件进行拟合,发现候选变异pbp1b641C与脑膜炎显著相关(P=2.28×10–6)(图2c)。使用GEMMA软件也得到相同的结果。与pbp1b基因相邻位点的变异与脑膜炎无显著相关性,与pbp1b641位点的连锁不平衡程度较低(图2d)。在该队列中,23.6%(42)脑膜炎病人和10.6% (247)的非脑膜炎病人受pbp1b641C型肺炎球菌感染。在2229个非pbp1b641C型分离株中,pbp1b的614位点是99.8%(2225)是A,0.2%(4)缺失。

 

图2验证队列肺炎球菌变异与脑膜炎的关系

 

3、pbp1b641C突变的功能影响

pbp基因家族涉及肺炎球菌对β-内酰胺抗生素的耐药性形成。耐药性形成的主要因素是PBP1a、PBP2b和PBP2x蛋白的变化,这些变化导致对抗生素的亲和性降低。为了探究pbp1b641C突变对β-内酰胺耐药性的潜在作用,验证队列分离株检测了对6种β-内酰胺抗生素(常用的治疗肺炎球菌感染药物,青霉素、阿莫西林、美罗培南、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛)的最低抑菌浓度(MIC)。286株pbp641C临床分离株和2222株非pbp641C临床分离株分别获得1716和13332个MIC值,其中10个分离株缺失了60个MIC值。六种抗生素的MIC值高度相关,两两相关性在0.84到0.95之间。pbp641C分离株和非pbp641C分离株对美罗培南(0.06 µg ml−1)、头孢噻肟(0.06 µgml−1)和头孢呋辛(0.5 µgml−1)的MIC中位值相等(图3a),而pbp641C分离株对青霉素(0.25vs0.06µgml−1)、阿莫西林(0.06vs0.03µgml−1)和头孢曲松钠(0.06vs0.03µgml−1)的MIC中位值高于非pbp641C分离株(图3)。仅青霉素的MIC中值的差异就超过了稀释倍数的两倍,但是具有相同多位点序列类型(multi-locussequencetype,MLST)的pbp641C和非pbp641C分离株对青霉素的MIC相同(图3b),说明pbp641C突变可能与β-内酰胺耐药性有关,但不是导致MIC升高的充分原因。

 

通过分析青霉素MIC线性混合效应模型,结合对pbp1b641C的固定效应和基于全基因组SNPs的群体结构随机效应,发现pbp1b641C对MIC的增加没有独立的贡献。相比之下,已知的与β-内酰胺耐药性相关的PBP改变(PBP2XT338A,R384G和L546V)显示出与青霉素MIC升高的高度显著相关(图3c)。类似的结果也在其他五种β-内酰胺抗生素中观察到。因此,pbp1b641C突变不太可能导致β-内酰胺耐药表型。

 

图3pbp1bA641C对临床分离株耐药性的影响

 

为了进一步探索pbp1b641C基因型的生物学效应,构建了一对同源实验室菌株R6和R6_641C(图4a)。亲本R6菌株中的pbp1b641A等位基因被pbp1b641C等位基因所取代,从而得到了候选变异的R6_641C菌株。全基因组测序证实了pbp1b641等位基因序列的突变。R6和R6_641C对抗生素的MIC值相当,青霉素(图4b,0.023µgml−1)和17种其他用于IPD的抗生素,A到D的突变没有产生耐药性。接下来,通过估计杀死人群中99%的细菌所需的青霉素治疗持续时间(MDK99),比较了R6和R6_641C的抗生素耐受性水平。在3µgml−1青霉素(>100倍MIC)中,R6_641C菌株与R6相比表现出显著的死亡速度降低(图4c)。R6_641C菌株的MDK99估计为522±57min(平均值±SD;图4d),明显长于亲本R6菌株(405±68min;P0.002;图4d)。

 

图4pbp1bA641C对同基因菌株抗生素耐药性和耐受性的影响

 

4、pbp1b641C突变的效应大小估计

使用混合效应逻辑回归模型估计了pbp1b641C对脑膜炎的影响大小,该模型明确地说明了肺炎球菌表型与毒力(血清型和抗生素耐药性)可能有关。

 

将模型拟合到验证队列,脑膜炎患者中感染pbp1b641C肺炎球菌比感染非pbp1b641C肺炎球菌的校正优势比(aOR)为2.83。与18-64岁的患者相比,小于2岁的患者患脑膜炎的风险更高(aOR=1.97),而大于64岁的患者患脑膜炎的风险更低(aOR=0.46)。得出的结论是,pbp1b641C似乎是IPD患者得脑膜炎的独立预测因子,其效应大小与患者年龄相当。

 

接下来,分析pbp1b641C和脑膜炎之间的关联是否由特定的流行病学亚群驱动(图5)。按患者年龄范围和监测地点(州)对分离株进行分层,利用上述混合效应逻辑回归模型对各层的pbp1b641C的效应大小进行估计。在5-17岁和大于64岁的患者中(图5a),以及俄勒冈州和康涅狄格州以外的其他州(图5b),这种相关性有增强的趋势。然而,没有证据表明pbp1b641C效应大小在亚组间存在显著差异(所有F检验P>0.05),表明SNP与年龄或监测位点之间缺乏相关性。

 

图5验证队列中pbp1b641C基因型对脑膜炎综合征的影响

 

5、pbp1b641C等位基因的分布

本研究检测的IPD分离株中,有9.5%(434例)存在pbp1b641C等位基因。该等位基因广泛分布于18个血清型和54个MLST。具有高比例pbp1b641C等位基因的血清型为5(6/6)、10A(69/82)、23A(138/164)、23B(103/127)、11A(74/118)、10F(2/2)和23F(22/58)。使用2015年ABCsIPD分离株,根据不同疫苗、患者年龄和地理位置的血清型,估计当前pbp1b641C的分布情况。在这个队列中,有289个分离株(11.5%)携带pbp1b641C等位基因,其中绝大多数等位基因(288/289)在1937个非PCV13血清型分离株中发现。超过三分之一的pbp1b641C(104/289)在1602株血清型包括在23价肺炎球菌多糖疫苗(PPSV23)中的分离株中发现。年龄<2、2-4、5-17、18-64、>64岁患者pbp1b641C频率分别为0.16、0.22、0.12、0.11、0.11,差异无统计学意义(Fisher精确检验,P=0.085)。10个州的pbp1b641C等位基因的频率分别为0.06(NM)、0.07(CA)、0.09(CO)、0.09(MN)、0.13(CT)、0.13(TN)、0.14(MD)、0.14(NY)、0.14(OR)和0.15(GA)。

 

 

研究结论

1、感染pbp1bA641C突变型肺炎链球菌的IPD病人得脑膜炎的概率升高;

2、在IPD患者中,肺炎球菌pbp1bA641C突变与菌的抗生素耐受性增加有关;

3、鉴定了pbp1bA641C突变型肺炎球菌的流行病学分布。

 

 

亮点

对IPD患者中分离出的肺炎链球菌进行全基因组测序,通过SNP和线性混合效应模型分析,鉴定出与脑膜炎相关的基因突变,大规模的测试队列和验证队列数据共同支撑了结论。且通过分子生物学实验构建突变菌株,直接证明了pbp1bA641C突变对菌耐受性升高的影响。

 

 

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全基因组测序探究脑膜炎侵入性肺炎球菌突变

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2019-10-30
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宏基因组测序(mNGS)检测总病原体(pan-pathogen)已经成功地应用在了对病因不明的急性疾病患者的检测中,提供了在一次试验中准确地鉴定几乎囊括了所有潜在的病原体(病毒、细菌、真菌和寄生虫)的方法。随着测序技术和生物信息学技术的发展,利用mNGS进行病原体检测展现出广泛的应用前景,但是仍面临着很多挑战: (1) 缺乏mNGS临床验证的标准; (2) 如何鉴别定植和感染微生物; (3) 缺少用于临床诊断的定制生物信息学软件; (4) 完善现有数据库的质量和全面性; (5) 临床实验室环境的改善。本文...[详细]
2019-10-29
首个亚洲家猪“超清”基因组图谱发布
近日,中国农业科学院农业基因组研究所猪基因组设计育种创新团队唐中林课题组在BioRxiv上预发表了论文Chromosome-scaledenovoassemblyandphasingofaChineseindigenouspiggenome。 该研究使用基因组denovo技术得到了首个超高质量的雄性陆川猪基因组。 由于中国本土猪与西方商品猪在表型和基因组特征上存在显著差异,构建一个有代表性的高质量中国本土猪参考基因组对探索基因功能、基因组进化和促进猪的遗传改良具有重要意义。 贝瑞基因为该研究提供基因组测序...[详细]
2019-10-25
高通量测序与分析软件、数据格式转换三代测序技术的硬核讨论
关于高通量测序与分析软件 Q:各位大神,我们用Nanopore 测序的数据,和参考基因组比较找片段差异,有什么好的软件推荐 A:片段差异是指SV吗? 做这个的话Sniffles还可以,mapping用他们推荐的NGMLR或者minimap2 A:sniffles是nanopore自己的发文章用的;好像还有个nanosv A:我们用pacbio的数据做sniffles,出来的结果很难解释,各种噪声 Q:感谢各位大神,我就是想用nanopore的长reads map一下基因组,看看特定区段上的序列插入缺失,确...[详细]
2019-10-25
全基因组测序探究与脑膜炎相关的侵入性肺炎球菌突变
革兰氏阳性菌肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)经常定植在人的咽部,通常会侵入无菌的身体部位引起侵入性肺炎球菌病(IPD),包括菌血症、菌血症性肺炎、脑膜炎。IPD是世界范围内发病和死亡的主要原因,而肺炎球菌性脑膜炎是IPD中更为严重的一种,具有高的死亡和永久性神经后遗症风险。肺炎链球菌的突变有时会引起脑膜炎,增加对脑膜炎相关的肺炎链球菌突变的了解,可以提高人们对发病机制的理解,并为预防策略提供信息。本文报告了IPD病人测试队列(n=2054)、独立的验证队列(n=2518)中,肺...[详细]
2019-10-14
  • nanopore测序技术专题(一):为什么要选择nanopore测序?
    为什么要选择nanopore测序技术,这是因为nanopore测序技术具有一些无与伦比的优势,可以解决很多技术难题。主要包括,超长读长,DNA/RNA直接测序,真正的实时性,无需对测序设备的资金投入,可扩展性:便携式或台式测序仪,10分钟文库制备,高保真度,对大基因组的高数据量测序。下面我们具体来介绍一下。 1超长读长 在纳米孔测序中,读长长度可以等于输入片段长度。读长长度不受限于测序设备,用户可以通过所使用的文库制备实验方案来控制片段长度。目前报到处DNA片段长度最高记录为2Mb,直接RNA测序读长最长...
  • 高通量测序与分析软件、数据格式转换三代测序技术的硬核讨论
    关于高通量测序与分析软件 Q:各位大神,我们用Nanopore 测序的数据,和参考基因组比较找片段差异,有什么好的软件推荐 A:片段差异是指SV吗? 做这个的话Sniffles还可以,mapping用他们推荐的NGMLR或者minimap2 A:sniffles是nanopore自己的发文章用的;好像还有个nanosv A:我们用pacbio的数据做sniffles,出来的结果很难解释,各种噪声 Q:感谢各位大神,我就是想用nanopore的长reads map一下基因组,看看特定区段上的序列插入缺失,确...
  • nanopore测序技术专题(二):一些典型应用
    前面一篇推文我们介绍了nanopore测序技术的一些显著优势,简单来说就是长读长、高产出、便携、实时、易用、直接。基于这些特点,在基因组或者转录组分析中可以有很多的应用,这次我们列举一些nanopore测序技术的一些典型应用。 大基因组拼接 nanopore最显著特点就是读长长。长读长对于大基因组的拼接将会产生立竿见影的效果。在以往基于短片段的基因组拼接中,由于一些动植物基因组本身具有多倍体,高度重复,高度杂合的特性,导致基因组拼接是一项异常艰难的工作,有些植物甚至复杂到利用短片段根本无法完成拼接工作,例...
  • nanopore测序技术专题(四):纳米孔测序原理
    对DNA测序本质上就是识别ATCG四种碱基,但是一方面四种碱基实在太小了,属于纳米级别,另一方面嘌呤和嘌呤,嘧啶和嘧啶之间化学结构非常相似,不容易区分。 从53年提出DNA双螺旋结构之后,生物学家一直努力通过各种办法识别四种碱基。 目前主流的方法包括将四种碱基转换为光信号,溶液PH值,以及转换为电信号,通过放大后的信号来区分四种碱基。 这也是目前主流测序仪的几种方案。 sanger,illumina,BGIseq,Pacbio等选择光信号,Iontorrent选择溶液PH值,而nanopore选择电信号。...
  • nanopore测序技术专题(三):选择适合你的测序设备
    nanopore是非常适合实验室单独运行的测序设备,无需投入大量资本。而不像二代测序,需要昂贵的购买测序仪成本以及运行成本。也许在不久的将来,测序仪将如PCR仪一样普通飞入寻常百姓家。这次内容我们将给大家介绍一下最新的nanopore测序相关产品。 注:本次内容全部来自nanopore官网产品近期介绍,经常会更新,更多内容大家可以自行去nanopore官方查看,或者联系他们公司人员,本次内容无广告赞助(哈哈哈)。产品介绍:https://nanoporetech.com/cn/products查看价格:h...
  • 鸟枪法宏基因组测序之外我们还能做什么?
    摘要 环境微生物组的探索揭示了在自然生态系统中起作用的生态和进化原理,重建群体基因组带来的以基因组为中心的研究进一步加速了其发展。 然而, 计算繁重的短读长组装 、 群落内的菌株异质性 以及 低丰度微生物所需的覆盖深度 仍然是传统鸟枪法宏基因组学要应对的技术挑战。 从这个角度出发,我们提出了未来有希望发展的三个主要方向,包括耦合 稳定性同位素示踪技术 与宏基因组、应用 荧光激活细胞分选技术 在较大的群落中靶向寻找微型宏基因组,以及利用 单分子长读长 和 合成长读长技术 将可移动元件与宿主微生物细胞相链接。...
  • nanopore测序技术专题(五):建库测序
    所谓建库测序就是对测序的DNA进行一些处理,是一个格式化的过程,需要将DNA处理成固定的模式才可以。例如需要给原始的DNA加上A碱基,接头,测序引物,index或者barcode标签等。建库测序是DNA测序过程中非常重要的一个环节,可以说直接影响到测序质量,建库效果不好,测序质量不可能好。 DNA提取 纳米孔可以测序DNA本身长度的读长,这就需要原始DNA具有的长度。因此,在测序之前能够提取到相对完整的DNA比较重要。由于不同物种DNA提取方法不同,这就需要依据一些不同样本提取的经验方法。例如植物基因组具...
  • 如何简化美化LEfSe分析结果中的Cladogram图
    写在前面 关于LEfSe分析,相信大家早已耳熟能详。网上也有很多指导如何做LEfSe分析流程的文章。可是在实际应用中,仍然会遇到一些问题。LEfSe以出图美观的优势吸引大家用它绘图,然而为什么同样的流程,我们做出来的图总是不如别人发在文章里的漂亮?比如,别人发表的图是这样的: 图1Leastdiscriminantanalysis(LDA)effectsizetaxonomiccladogramcomparingallsamplescategorizedbyfourbacterialprovinces.引...
  • 双11,选择一款适合做生物信息的笔记本
    所谓工欲善其事,必先利其器,选择一款好的笔记本电脑来做生物信息是非常有必要的,何况通哥有句名言用一台比较快的电脑,等于延长了生命。作为混迹数码行业10多年的人来说,对各种科技产品当然是了如指掌,如数家珍。前段时间还有人咨询我如何选择一台好的笔记本,正好最近又看到圈内有人求助,这次就让被生物信息耽误的数码编辑带大家选择称心如意的笔电产品吧。 尽量不要用笔记本来跑数据 题目说是推荐适合做生物信息的笔记本电脑,又说尽量不要用笔记本来跑数据,这不是矛盾吗?是的。虽然不能用来跑数据,但是用来练习总是可以的。跑数据尽...
  • nanopore测序技术专题(七):测序结果文件介绍
    前面我们已经介绍了很多关于nanopore测序的一些内容,希望你能够对于nanopore测序有所了解。从这次内容开始对数据分析部分进行介绍,至于如何提取你样品的DNA,这部分涉及内容很多,不同的样品有不同的处理方法,我不了解你研究的项目,也不感兴趣,我要是感兴趣就没你什么事了。所以,这部分自己摸索,科学就是不断探索的过程。至于拿到DNA如何建库测序,可以参加nanopore官方提供的实验培训,好像9000多一天,听起来挺贵,但其实可以自带样品测序。如果有需要,自己去关注吧。 获取nanopore测序数据 ...