2019-11-08 15:29:59 热度:

circRNA的蛋白编码能力文献:环状LINC-PINT编码的肽抑制胶质母细胞瘤的致癌转录延伸

导读

 circRNA的翻译能力的预测与研究已成为当前circRNA功能分析的热点。

之前看过一篇circRNA编码能力机制文章“circRNA的蛋白编码能力文献(10.211)”。

与之前circRNA蛋白表达分析文章不同的是本文的circRNA中连接位点处于ORF外,这使得验证circRNA编码的方法变得困难。

然而,作者筛选了源基因编码lncRNA而非mRNA的circRNA作为研究对象,用巧妙的实验方法验证了circRNA编码的蛋白。

摘要

 环状RNA(circRNA)是哺乳动物基因组中的一大类转录物。

尽管已有circRNA翻译的报道,但其他编码circRNA及其翻译产物的功能仍然难以捉摸。

在这里,我们证明了从长非编码RNA产生的内源性circRNA编码调节肽

通过核糖体新生链复合物结合的RNA测序(RNC-seq),我们发现了circRNAs可能编码的几种肽。

我们确定一个87氨基酸的长周期的非蛋白编码RNAp53诱导环状转录本(LINC-PINT)的编码,该转录本在体外和体内抑制胶质母细胞瘤细胞增殖。

该肽直接与聚合酶相关因子复合物(PAF1c)相互作用并抑制多种癌基因的转录延伸。

与正常组织中的水平相比,胶质母细胞瘤中该肽及其相应circRNA的表达降低。

我们的结果发现由circRNA编码的肽的存在,并证明了它们在胶质母细胞瘤肿瘤发生中的潜在功能。

 

前言

 最近的证据表明,功能肽由ncRNA中的短开放阅读框(sORF)编码。

另外,某些合成的circRNA是可翻译的,这引发了一个问题,即哺乳动物细胞中含有sORF的天然circRNA是否被翻译成蛋白质或肽。

目前,已经采用了三种广泛的策略来鉴定ncRNA中的sORFs。

这些策略包括跨物种比较以识别保守序列,检查密码子含量或特征以区分潜在的编码sORF,以及翻译方法以识别编码sORFs。

结果

 

1   潜在编码circRNA的高通量测序

为了生成circRNA和RNC-RNA的RNA-seq数据集,我们使用了来自正常人星形胶质细胞(NHA)和U251胶质母细胞瘤细胞的除核糖体RNA的总RNA和RNC-RNA

在IlluminaHiSeqTM4000上分别对总RNA和RNC-RNA进行测序(做RNAseq鉴定circRNA,及潜在编码多肽的RNA,该实验可以找我们提供服务)。

将获得的读数映射到参考核糖体RNA(Bowtie2,http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/)和参考基因组(http://ccb.jhu.edu/software/tophat/),以及来自两端的20聚体提取未映射的读数并与参考基因组比对,以鉴定剪接位点内的独特连接位点。

以相反方向排列的连接读数表明了circRNA的剪接,使用find_circ(https://omictools.com/find-circ-tool)鉴定circRNA。

然后扩展锚定比对方式,以使完整的读段对齐,并在GU/AG剪接位点侧接断点。

如果有至少两个特殊的反向剪接读数支持,则为候选circRNA。

由于RNC-seq的识别率可能较低,因此我们设计收集的RNC-seq数据是RNA-seq的四倍。

通过测序,总共鉴定出15189个circRNA(来自RNA-seq的7017个和来自RNC-RNAseq的12863个),其中4597个在circBase中成功匹配。

在这些候选物中,分别从总RNA或RNC-RNA中鉴定出4840和666个差异表达的circRNA,其错误发现率(FDR)≤0.01,倍数变化≥2。

我们从总RNA和RNC-RNA中交叉匹配这些差异表达的候选物,并进一步鉴定出320个共有的circRNA。

对这些circRNA的原基因(274个基因)进行了基因本体论(GO)富集分析,并对该基因集的GO分子功能进行了富集(FDR<0.05),包括蛋白质结合和细胞成分组织。

大多数circRNA与它们蛋白编码的原基因共享相同的CDS。

为了进一步排除假阳性数据,我们仅关注了这274个候选基因中的原基因为非编码RNA。

总共发现了十个非编码原基因,其中五个具有编码潜能(补充表4)。

经过初步筛选,我们将重点放在LINC-PINT(ENSG00000231721)上进行进一步的研究。

LINC-PINT是一种抑制肿瘤的长基因间非编码RNA(lincRNA),与Polycomb抑制复合物2(PRC2)有关。

到目前为止,没有证据表明LINC-PINT是编码RNA。

(注:通过RNA-seq和RNC-seq鉴定两种细胞系中的circRNA,取差异表达的交集做GO分析,并筛选源基因为非编码RNA并有蛋白编码潜能的circRNA作为研究目标)

 

2   鉴定由LINC-PINT外显子2形成的circRNA

   我们首先在测序数据中可视化了LINC-PINT外显子2的反剪接读数。

RNC-RNA组有15个反向剪接的连接特异性读取,而总RNA组有7个读取,这表明LINC-PINT的外显子2被鉴定为可翻译的环状RNA。

值得注意的是,外显子1和外显子3的读数远低于RNC-seq中的外显子2的读数,这表明线性LINC-PINT不被翻译。

LINC-PINT的长外显子2,包含3'AG受体和5'GT供体序列需要反向剪接,在人CircBase中被鉴定为circRNA(具有circ-0082389)。

我们首先确定LINC-PINT的外显子2是否在人细胞中形成了内源性circRNA。

Q-PCR和荧光原位杂交(FISH)分析与专为检测圆形连接或线性连接而设计的引物/探针进一步证实了人细胞系中LINC-PINT外显子2的头对尾拼接环形形式的存在。

线性LINC-PINT和circPINTexon2均在人神经干细胞(hNSC)和293T细胞中表达,但在不同的神经胶质瘤/脑肿瘤启动细胞(BTIC)细胞系中它们的表达下降。

LINC-PINT和cir-cPINTexon2呈现出不同的细胞定位:线性LINC-PINT主要位于细胞核,而cir-cPINTexon2大多是胞质的。

(注:鉴定circPINTexon2为circRNA,并发现一些与LINC-PINT的差异)

 

3   CircPINTexon2编码肽

为了检验circPINTexon2是否可翻译的假设(在RNC-seq中鉴定出circPINTexon2接头读数,并且LINC-PINT上的外显子2读数远高于外显子1和外显子3),我们首先分析了LINC-PINT外显子2中所有推定的sORF。

我们在这个外显子中鉴定出两个sORF,可能编码长度为69aa和87aa的肽,在多个物种中高度保守。

为了探索这些假定的ORF是否具有活性,我们将LINC-PINT的全长外显子2克隆到了PLCDH-ciR载体(带有人工侧翼序列和SA/SD序列)中,该载体含有绿色荧光蛋白(GFP),都没有启动子,终止密码子紧接在两个sORF终止密码子上游。

免疫荧光(IF)结果显示,在上述载体过表达的情况下,只有编码87-aa肽的第二个sORF在293T细胞中表达,但仍需要进一步研究以显示87-aa肽在体内是由内源性circPINTexon2而非线性LINC-PINT翻译的。

(注:从RNC-seq数据中发现circPINTexon2具有翻译能力,载体验证表达的sORF)首先,证明circPINTexon2包含天然的内部核糖体进入位点(IRES),这是在不依赖于5'-帽的编码RNA中启动翻译所必需的,我们进行了生物信息学分析和IRES活性测试。

将mCherry和GFP克隆到具有或不具有假定的IRES(87-aasORF上游478bp)或它们之间有指定突变的双顺反子报告基因构建体中。

在正常的eIF4E条件下,假定的IRES均检测到mCherry和GFP。

相反,如果删除了假定的IRES,则仅检测到mCherry。

当删除87-aasORF上游的-478至-231序列时,未检测到GFP,表明IRES位于该区域。

当eIF4E被抑制时(用4EGI-1处理),假定的IRES诱导GFP的表达,但不诱导mCherry的表达。

因此,circPINTexon2中的天然IRES诱导进入核糖体并启动翻译。

为了定量测试circPINTexon2IRES的活性,我们使用了串联的Rluc–Luc报告质粒,其中RlucORF由CMV启动子驱动,而LucORF在RLuc终止密码子后立即融合,而在它们之间没有任何启动子。

我们在RLuc和Luc之间克隆了IRES-478bp,IRES-209bp和IRES-231bp序列,并针对每种质粒测量了Luc相对于RLuc的荧光素酶活性。

IRES-478bp和IRES-231bp的Luc/Rluc活性明显高于空载体,这进一步支持了活性IRES位于87-aasORF上游的观点。

(注:IRES预测和载体验证IRES活性)基于以上信息,我们产生了针对87-aa肽的抗体。

免疫印迹表明该抗体成功识别了预测的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白。

使用该抗体进行内源性免疫沉淀,然后在293T细胞中进行LC-MS/MS,进一步证实了10-kDa肽序列与预测的87-aasORF相匹配。

由于87-aasORF不包含circPINTexon2连接位点,我们设计了几种合成质粒来进一步测试该circRNA的编码能力。

在circPINTexon2载体中,circRNA连接位点在87-aasORF内部,由侧翼序列诱导的该质粒的环化导致形成与天然circPINTexon2相同的circRNA。

相比之下,circPINTexon2载体的线性阅读框中没有显示87-aasORF。

在northern印迹和western印迹表明该合成质粒的转染成功地成功表达了circPINTexon2和87-aa肽。

这种合成的circRNA质粒诱导的87-aa肽过表达与CMV驱动的线性87-aasORF过表达质粒的表达一样强,证明circRNA的翻译效率很高。

接下来,我们使用了两个专门针对circPINTexon2环状连接的siRNA。

连接位点特异性siRNA成功降低了circPINTexon2和87-aa肽水平,而没有影响线性LINC-PINT。

相反,专门针对线性LINC-PINT设计的两种反义寡核苷酸(ASO)并未降低circPINTexon2或87-aa肽的表达。

此外,在293T/hNSC中线性LINC-PINT的稳定过表达不能提高PINT87aa的表达。

总的来说,这些结果表明87-aa肽是由circPINTexon2产生的,而不是由线性形式的LINC-PINT产生的。

我们将该肽命名为PINT87aa。

(注:进一步验证翻译的多肽是由circRNA编码而非lncRNA编码)

 

图 circPINTexon2编码87-aa肽。

 a如图所示,将全长或截短的circPINTexon2IRES(478、231和209bp)克隆到mCherry和GFP之间,以构建几个报告质粒。

将这些质粒转染到293T细胞中,进行或不进行4EGI-1处理。

进行中频以确定mCherry和GFP信号。

比例尺,50μM。

 bRluc和Luc串联克隆到荧光素酶报道质粒中,两者之间有或没有所示的截短的IRES。

在每个转染的质粒中测量Luc/Rluc活性。
 

 

4   PINT87aa的体外肿瘤抑制作用

为了研究其可能的生物学功能,我们首先检测了PINT87aa的细胞定位。

使用RFP融合蛋白标记,我们发现该肽集中在细胞核中,表明PINT87aa发挥潜在的细胞调节作用。

接下来,我们在几种人体组织中检测到circPINTexon2和PINT87aa基线表达。

CircPINTexon2和PINT87aa在脑,肝,肾和胃中表达,但在乳腺,肠,甲状腺和胰腺组织中表达较低。

circPINTexon2和PINT87aa表达的降低也反映了临床神经胶质瘤样本中的WHO分期。

为了确定PINT87aa在肿瘤细胞中的生物学作用,我们建立了稳定过表达线性PINT87aa-GFP载体或环形circPINTexon2载体的456和4121细胞。

此外,我们生成了CRISPR/Cas9诱导的PINT87aaK.O.SW1783和Hs683细胞。

与相应的对照细胞相比,过表达线性PINT87aa和circPINTexon2的456和4121细胞均显示G1阻滞并减少了细胞增殖,而没有明显的细胞毒性,而PIN-T87aaK.O.SW1783和Hs683细胞显示出增加的细胞周期和细胞增殖速率。

过表达线性和环状载体的456-PINT87aa和4121-PINT87aa细胞均显示出显着的生长减少,而PINT87aaK.O.SW1783和Hs683细胞在平板菌落和软琼脂中显示出增强的细胞增殖能力和恶性表型。

根据以上结果,我们表明circPINTexon2通过PINT87aa而不是circPINTexon2发挥其抑癌功能。

(注:实验验证circRNA通过翻译多肽发挥抑癌作用) 

5   PINT87aa调节多种致癌基因的RNA

为了进一步探讨PINT87aa抑制肿瘤功能的潜在分子机制,我们首先检查了一些在PINT87aa过表达的BTICs胶质瘤发生中起关键作用的原癌基因。

但是,在PINT87aa或circPINTexon2过表达后,EGFR,MET和PDGFR不变。

接下来,我们在过表达PINT87aa-3XFlag的293T细胞中进行了免疫共沉淀,以鉴定其潜在的靶向分子。

如图6a所示,使用抗Flag抗体对用PINT87aa-3XFlag转染的293T细胞和相应的对照细胞进行免疫沉淀。

对沉淀物进行LC-MS/MS鉴定,以鉴定潜在的与PINT87aa相互作用的蛋白。

在各种候选物中,发现PINT87aa可能与PAF1蛋白复合物结合。

为了研究PINT87aa与PAF1之间潜在的直接相互作用,使用PEP-FOLD对PINT87aa构象进行建模,并根据PTRAC-SiteFinder的ATTRACT2将其结合至PAF1。

通过PyMOL(PyMOL分子图形系统,版本1.8Schrödinger,LLC)以不同的颜色显示与PAF1结合的前十个肽,同时标记了蛋白-肽界面残基(每个肽5Å以内)。

PINT87aa最有可能直接与PAF1的中间区域相互作用。

使用纯化蛋白进行的直接结合测定进一步表明,PINT87aa与PAF1的150–300-aa结构域相互作用,并且PINT87aa中R20,G21,P23,C32,R36和S53的氨基酸对于PAF1相互作用至关重要。

此外,GFP-PINT87aa和PAF1共定位在细胞核中,这表明PINT87aa可能参与了PAF1靶基因的调控。

PAF1复合物参与RNAII聚合酶(PolII)募集并上调下游基因的转录,证据表明PAF1在人类肿瘤,包括神经胶质瘤,发生过程中调节潜在的癌基因。

我们在过表达PINT87aa的456和4121细胞中进行了进一步的实验,以确定PINT87aa是否参与PAF1靶基因的调控。

与过表达的对照细胞相比,在过表达PIN87aa的456和4121细胞中,PAF1下游基因的mRNA,包括CPEB1,SOX-2,c-Myc等,在转录上受到抑制。

在Hs683和SW1783细胞中,这些基因的表达在mRNA和蛋白质水平上均增加。

进一步的第二次ChIP分析表明,PINT87aa和PAF1共同位于CPEB1启动子中,表明PINT87aa参与了PAF1/PolII复合物的调控。

但是,PINT87aa的过表达并没有改变456或4121BTIC中的PAF1表达。

相反,PINT87aa增强了PAF1及其靶基因的启动子相互作用。

PINT87aa的过表达或敲低分别增强或降低了PAF1/CPEB1启动子的亲和力,表明PINT87aa可以决定PAF1/CPEB1启动子的相互作用。

我们认为PINT87aa可能起锚作用,并使PAF1复合物保持在靶基因的启动子上,从而使PolII诱导的mRNA延伸暂停。

使用特异性ASO在SW1783和Hs683细胞中的LINC-PINT敲低可提高细胞活力,但不会改变PAF1下游基因的mRNA或蛋白质水平,表明LINC-PINT和PINT87aa参与了不同的信号传导途径。

LINC-PINT受p53调控,在p53野生型或突变细胞中,我们都没有发现PINT87aa改变p53表达或影响p53下游靶标。

相反,在A172和293T细胞中p53的过表达可能上调PINT87aa。

我们推断,PINT87aa的生物学功能独立于LINC-PINT,尽管它们可能都受p53调控。

显然,仍然需要进一步的研究来阐明PINT87aa的上游信号。

(注:验证PINT87aa的靶蛋白和下游通路)

 

6   PINT87aa的肿瘤抑制作用

为了解PINT87aa的潜在临床意义,我们检测了人胶质瘤样本和配对的正常组织中circPINTexon2和PINT87aa的表达。

CircPINTexon2和PINT87aa在邻近肿瘤的正常脑组织中表达,但在所有脑肿瘤组织中的表达均下降,类似于LINC-PINT。

我们在其他人类恶性肿瘤(包括乳腺癌,肝细胞癌和胃癌)中获得了关于circPINTexon2和PINT87aa表达的相似结果。

显然,circPINTexon2和PINT87aa下调在人类恶性肿瘤中是常见的。

在动物模型中,456细胞和4121细胞稳定过表达PINT87aa的线性或环状质粒与对照细胞相比,根据肿瘤生长和动物存活率评估的肿瘤发生潜力降低,进一步支持了PINT87aa肽在体内的抗癌作用。

(注:PINT87aa临床意义)

图 circPINTexon2和PINT87aa的临床意义。

circPINTexon2和PINT87aa在具有不同WHO分期和相匹配的正常组织的人脑胶质瘤样品中的表达,circPINTexon2和PINT87aa在乳腺癌,肝细胞癌,胃癌和邻近正常组织中的表达。
 

讨论

 

CircRNAs是人类转录组广泛存在的RNA种类。

除了充当通过吸附microRNA基因表达或发展的调节剂,circRNAs最近证明是人类恶性肿瘤的关键。

然而,只有少数circRNAs包含多个完美的microRNA陷阱点,这提出了问题:circRNAs展示功能是否超过作为microRNA海绵功能。

最近的证据证实了ncRNA中从sORFs转换而来的功能肽的存在,包括前microRNA和lncRNA,这表明这些ncRNA的编码潜力被大大低估了。

为了探索circRNA的编码潜力,我们进行了RNC-RNA深度测序,并证实了内源性circRNA(circPINTexon2)编码人细胞中的肿瘤抑制肽。
 

方法

 人类癌症和正常组织

 

所有人癌组织和癌旁组织均取自中山大学附属第一医院。

在获得知情同意的情况下获得了人体材料,并且该研究获得了临床研究伦理委员会的批准。

目标circRNA的生物信息学分析和鉴定短读序列比对工具Bowtie2用于将读序列比对到rRNA数据库。

然后去除了比对的rRNA读数。

其余读数进一步进行比对和分析。

然后使用TopHat2(2.0.3.12版)将去除rRNA的读段定位到参考基因组(人类基因组hg38)。

使用内部perl脚本根据bam文件中记录的定位信息丢弃映射到基因组的读段,然后收集未映射的读段用于circRNA鉴定。

接下来,使用内部perl脚本从未映射读段的两端提取20聚体,并将其与参考基因组(bowtie2,版本2.3.0)对齐,以在剪接位点中定位独特的锚点位置。

以相反方向(从头到尾)排列的锚定读段指示circRNA剪接,然后使用find_circ(1.2版,https://github.com/marvin-jens/find_circ/)以识别circRNA。

然后扩展锚定比对,以使完整的比对读取和断点位于GU/AG剪接位点的侧面。

如果来自至少一个样品的至少两个独特的反向剪接读数支持,则将其作为候选circRNA。

根据Ensembl数据库(http://www.ensembl.org/)的gtf文件,使用内置的perl脚本确定鉴定出的circRNA的原基因。

还对circRNA使用circBase进行blast,以确定它们是否已被报道。

未注释的circRNA定义为新发现的circRNA。

为了量化circRNA,使用以下公式将反向剪接的连接读段缩放为RPM(每百万个映射读段的读段): 在该公式中,C是唯一与circRNA对齐的反向剪接连接读数的数目。

N是反向拼接结读取的总数。

使用在线数据分析平台(OmicShare)中的edgeR进行差异表达分析(www.omicshare.com/tools)。

使用edgeR的默认参数,并根据log2Foldchange≥1和q值>0.05选择差异表达基因(DEG)。

由于没有重复性研究,因此根据edgeR官方手册的建议,将生物学变异系数(BCV)(即分散体的平方根)设置为0.01。

对差异表达的circRNA的基因进行了GO富集分析。

 

统计分析除非另有说明,否则使用Prism(GraphPad)软件进行统计测试。

数据表示为平均值±S.E.,来自三个独立的实验。

对于参数数据,使用了不成对的两尾学生t检验。

对于非参数数据,使用双面Mann-Whitney检验。

假定数据分发是正常的,但是尚未经过正式测试。

使用基于ELDA网络的工具(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/),通过卡方检验分析了用于测试神经球形成能力的有限稀释法。

P<0.05的水平表示显着差异。

对于所有实验,一式三份进行分析。

出于任何原因,没有动物或数据点被排除在分析之外。

在所有实验中进行盲和随机化。

上文各节介绍了RNA-seq数据的统计分析。

本文的研究思路:1.通过去rRNARNAseq、及核糖体富集RNA测序,鉴定胶质母细胞瘤中的circRNA及可能编码多肽的RNA。

对差异的circRNA及其来源基因的GO功能等进行描述。

2.挑选编码多肽circRNA,circPINTexon2。

筛选时选了一个来源基因为lncRNA的。

3.证明circPINTexon2确实可以编码多肽。

4.过表达circPINTexon2看其对细胞表型的影响。

5.对编码的多肽pulldown结合的蛋白,找调控的下游蛋白及机制。

6.在临床样品检测其表达,在动物模型中过表达证明其对肿瘤的抑制作用。

生物生物专业提供circRNA测序,circRNA的鉴定、circRNA蛋白编码潜力的预测(ORF和IRES)、GO通路富集分析等。

有需要的老师,可以与我们联系。


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ApeptideencodedbycircularformofLINC-PINTsuppressesoncogenictranscriptionalelongationinglioblastoma

环状LINC-PINT编码的肽抑制胶质母细胞瘤的致癌转录延伸

 

期刊:NatCommun

发表单位:中山大学附属第一医院神经外科

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