2019-10-12 15:22:50 热度:

Hyongsok Tom Soh, Trevor A:搭建结构转换适配体的策略

适配体与靶标结合时会发生构象变化,这种结构转换可通过各种读数(包括荧光或电化学信号)呈现,具有特异性(存在非特异性靶标,不会发生构象变化,也不会产生信号)和重现性(经化学合成得到、更易于设计和化学修饰)。

作者总结了基于适配体的结构转换功能搭建的生物传感器的基本原理,包括适配体信标、分裂适配体传感器和应变位移传感器这三类,并结合适配体的结构切换思想建立筛选适配体新策略。为优化适配体与靶标结合态和游离态之间的最佳热力学平衡,需要通过序列设计和实验的迭代过程来确定对其性能影响最大的变量。

 

图1适配体信标

 

向适配体两端标记荧光基团和淬灭基团,如图1(A)所示无靶标时适配体呈发夹结构,荧光淬灭。加入靶标后,适配体构象变化,荧光基团与淬灭基团间的距离拉大,荧光增强。但这样的茎环结构不稳定,会使得体系荧光背景增强,过于稳定则会减缓靶标与适配体的结合速率。有学者提出如图1(B)所示的“反向适配体信标”结构,在无靶标的体系中呈随机态,荧光信号强。加入靶标诱导适配体折叠,荧光淬灭。

作者首先通过数学模型分析适配体信标与靶标的结合过程,体系转换如下:

其中L(适配体信标)由R态(随机分布的荧光构象)向S态(趋于结合靶标的荧光构象)转化,加入T(靶标)后形成S·T(适配体-靶标复合结构)。

然后通过公式判断适配体茎环结构的稳定性:

(Feq是荧光读数,α是荧光基团浓度,[L]i是适配体初始浓度,[T]i是靶标初始浓度)

最后通过公式中的κ值判断茎环的稳定程度,当结构不够稳定时KR≠0且0<κ<1。

 

 

图2劈裂适配体

 

如图2(A)所示,选择不结合靶标的位点,劈裂适配体并标记荧光基团和淬灭基团,靶标会拉近适配体片段,基团间距缩短的同时减弱荧光信号。而劈裂链段间也可能存在非靶标促使相互作用,体系荧光背景信号较大。有学者提出如图2(B)所示的原理图,利用靶标与适配体片段的特异性结合,通过一个共价接近连接反应(叠氮-烷基环加成反应)诱导适配体片段末端的永久组装。这种由靶标诱导的连接,在放大信号的同时,降低体系背景值。

同样,作者先通过数学模型分析适配体信标与靶标的结合过程,体系转换如下:

其中A1(标记荧光基团的劈裂适配体片段)和A2(标记淬灭基团的劈裂适配体片段)由向S态(趋于结合靶标的荧光构象)转化,加入T(靶标)后形成S·T(适配体-靶标复合结构)。但体系中的A1和A2在不借助靶标的情况下,仍可能存在相互作用相互结合形成状态U,如下所示:

KU值虽然很小,但依旧影响体系的平衡,需要借助公式进一步的判断体系状态:

(ΔF=Feq-Fi是平衡态荧光读数与初始荧光读数的差值,α是荧光基团浓度,[A1]i是标有荧光基团的劈裂适配体片段的初始浓度,[T]i是靶标初始浓度)

 

最后可通过公式中的γ值判断体系状态,若KU≠0,γ>1,则存在极大的背景信号。当劈裂适配体片段A1和A2间非靶标促使的相互作用极弱时,KU→0,γ→1,ΔF∙α=−[T]i,此时荧光的降低与目标浓度成正比。

 

 

图3链置换策略

 

适配体与互补链经碱基互补配对结合,使得标记的荧光基团和淬灭基团相互靠近,荧光信号弱。靶标与适配体的结合让互补链脱离的同时,促使适配体折叠产生荧光信号。该法具有高度可推广性,几乎可以将任何适配体转化为生物传感器。体系转换如下:

 

A∙Q(荧光基团标记的适配体与淬灭基团标记的互补链结合)与A+Q(A与Q为随机游离的荧光构象)可相互转化。适配体A也能向S态(趋于结合靶标的荧光构象)转化,加入T(靶标)后形成S·T(适配体-靶标复合结构)。与适配体信标相似,互补碱基个数过多,过度的稳定性会减缓靶标与适配体的结合反应,使得A·Q→S的转换变得困难。因此,需要找到最佳互补位点及互补碱基数,使体系处于更低的背景信号中,且具有更快的动力学。

当适配体的解离常数Kd和平衡常数KS极低时,可得平衡荧光近似表达式:

 

(Feq是体系平衡态的荧光读数,α是荧光基团浓度,[A·Q]i是适配体-互补链的初始浓度,[T]i是靶标初始浓度)

 

最后可通过公式中的σ值判断体系状态,体系达到最佳平衡时,荧光的降低与目标浓度成正比。而0<σ<1,则存在极大的背景信号。

 

 

图4链置换筛选适配体的策略

 

如图4(A)所示,Structure-switchingSELEX筛选技术是在磁珠上偶联一段序列,这段序列与随机核酸库中5’端引物的结合位点互补,只有与靶标结合且构象改变的序列才能从磁珠中释放出来,收集并放大。该法的局限性在于:引物序列必须对最终适配体结构起作用,在一定程度上限制了可能被富集的序列的范围。故有学者在此基础上提出了如图4(B)所示的Capture-SELEX筛选技术,通过设计核酸库,使得与磁珠上的链段互补的序列处于适配体的随机区域内,利用靶标将与其具有高亲和力的适配体从磁珠中释放出来,收集并放大,该法不需要引物序列参与靶标的结合。

 

 

点评:

1.对各类基于“结构转换”适配体的荧光生物传感器的基本原理进行了整合,并通过建立数学模型,对各个策略的热力学平衡过程进行分析。

2.探讨了利用链置换策略筛选适配体的过程。

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