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小麦抗白粉病基因Pm16和Pm30

 1.小麦抗白粉病基因Pm16的发现和细胞遗传学定位   

    小麦野生祖先种蕴含着优异的抗白粉病基因,利用传统的遗传学方法可将其导入到普通小麦中,为小麦抗病育种创制新的抗病资源。

1991年,英国剑桥实验室(CambridgeLaboratory,JohnInnesCentre前身)Reader和Miller通过鉴定发现希伯来大学考古队于1977年从以色列撒玛利亚山脉(SamarianMountains,耶路撒冷北部)收集的野生二粒小麦品系CL1060025(2n=4x=28,AABB)高抗小麦白粉病。

之后利用普通小麦品种MarisNimrod(含有抗白粉病基因Pm2)为母本,野生二粒小麦品系CL1060025为父本进行杂交,获得五倍体杂种一代,经自交两代获得F3代纯合抗病个体。

在此过程中,利用对当时已知所有抗白粉病基因(包括Pm2基因)具有毒性的白粉菌系进行温室接种鉴定,并对杂种和杂种后代的有丝分裂和减数分裂染色体行为进行观察,挑选含有19个二价体和2个单价体且纯合抗病的F3代植株再与普通小麦品种Norman(含有Pm2基因)进行杂交,挑选含有21个二价体的单株继续回交四次,获得了与轮回亲本Norman植株形态非常接近,且具有白粉病抗性的小麦品系。

对杂交和回交后代植株的白粉病菌接种鉴定可见三种表型:免疫类型叶片上未见侵染病斑,只有个别单株的第一片叶尖部分有轻微的褪绿斑,后代家系鉴定为纯合抗病植株;感病类型的植株大部分叶片上有大量的孢子堆,没有明显的褪绿斑,为纯合感病植株;这两类之间的单株为杂合抗病,叶片上有轻微的病斑,并伴有轻薄的孢子堆、褪绿斑和坏死斑,至第二个分蘖出现后,侵染的叶片上侵染斑逐渐扩大,退绿斑会扩展到老叶的叶尖。

早期回交世代杂合单株的后代分离群体呈3:1的抗感分离比,表明从野生二粒小麦导入到普通小麦的抗白粉病基因是显性单基因。
 

    随后利用中国春单体系对该抗白粉病基因进行了染色体定位。

绝大部分的单体系与抗病纯系杂交后代单体植株的自交后代依然表现3:1的抗感分离比,进一步表明从野生二粒小麦导入到普通小麦的抗白粉病基因为显性单基因。

除个别杂交后代种子量偏少外,只有4A单体系杂交后代的单体植株自交后代显著偏离3:1的抗感分离比(表1),对仅有的1个感病单株进行减数分裂染色体观察,发现该单株含有1个端体单价体,推测4A染色体与白粉病抗性相关,抗病基因可能位于缺失的染色体臂上。

Reader和Miller将该抗白粉病基因正式命名为Pm16,这是第一个由野生二粒小麦导入到普通小麦的抗白粉病基因(Reader&Miller,1991)。
 

表1抗白粉病基因Pm16的单体分析结果(引自Reader&Miller1991)

2.小麦抗白粉病基因Pm30的发现和分子标记定位

   1994年原北京农业大学杨作民教授从以色列海法大学(UniversityofHaifa,Israel)EviatarNevo教授处引进了28份野生二粒小麦,发现绝大部分对我国当时的白粉菌11和15号菌系具有良好的抗性。

随后利用普通小麦感病品系87-1和燕大1817作为母本,与其中的高抗白粉病野生二粒小麦品系C20(来源于以色列RoshPina地区)配制杂交组合,利用京冬8号和京411进行回交,创制了多个抗白粉病普通小麦-野生二粒小麦渗入系。
 

    刘志勇在中国农业大学孙其信教授实验室攻读博士学位期间对杨作民教授创制的一个普通小麦-野生二粒小麦渗入系87-1/C20//2*京冬8号的BC2F2和BC2F3抗病单株自交分离群体进行了白粉病抗性鉴定,发现其抗病性符合显性单基因遗传模式,并在多个后代衍生家系中均观察到相同的遗传模式(表2),后将该基因命名为Pm30(Liuetal.,2002)。
 

表2野生二粒小麦C20导入普通小麦的抗白粉病基因Pm30的遗传分析

    为了发掘与Pm30连锁的分子标记,利用BC2F3代纯合家系构建了抗病和感病混合池,采用BSA策略筛选了400个10碱基寡核苷酸RAPD引物,找到9个可在抗感池间扩增出多态性的引物,但经在分离群体上验证发现均与抗病基因并不连锁。

之后又筛选了200对大麦和小麦基因组的STS引物,也未在抗感混合池间检测到与抗病基因连锁的多态性扩增产物。

最后筛选了80对小麦基因组微卫星引物,发现引物WMS159扩增出的多态性片段与抗白粉病基因Pm30连锁(图1),利用两个分离群体验证发现该多态性标记与Pm30遗传距离为5.43-5.96cM。

利用中国春缺体-四体材料对WMS159扩增出的与抗病位点连锁的三个多态性条带Xgwm159/400、Xgwm159/430和Xgwm159/470进行染色体定位,发现这三个条带在中国春缺体-四体系N5B-T5A和N5D-T5A中扩增不出特异目标片段,说明其位于染色体5B或者5D上。

之后又利用中国春双端体材料进行染色体臂定位,结果只在5BL和5DL双端体中扩增不出特异目的片段,表明Pm30基因位于5BS或者5DS染色体臂上,这与分子标记Xgwm159定位于5BS和5DS的结果一致(Röderetal.,1998)。

鉴于所研究的遗传材料87-1/C20//2*京冬8号为普通小麦-野生二粒小麦渗入系,抗白粉病基因来源于野生二粒小麦AABB基因组,因此推断Pm30位于染色体5BS上;之后利用中国春5BS染色体臂缺失系材料进行多态性引物扩增,结果表明Pm30很可能位于5BS-Bin0.41-0.43染色体区间(Liuetal.,2002)。
 

图1 小麦抗白粉病基因Pm30的微卫星标记Xgwm159(引自Liuetal.2002)

 

3.小麦抗白粉病基因Pm16的分子标记定位

国内抗白粉病基因Pm16载体品种主要来源于中国农业科学院植物保护研究所麦类病害研究组引进的英国强冬性小麦品种Brigand,被作为小麦抗白粉病基因的鉴别寄主,对国内的绝大多数白粉病菌系表现免疫或高抗,对个别毒性较强的菌系也表现中抗(IT2),有轻薄的孢子堆,尚未发现对Brigand具有致病性的白粉病菌系(周益林研究员私人通讯,Wangetal.,2005)。

另一个来源是中国农业科学院作物科学研究所贾继增研究员从英国剑桥实验室Reader博士处引进的野生二粒小麦品系CL1060025后代品系Normanline,后用国内小麦品种北京837连续回交改良,创制出抗白粉病基因Pm16近等基因系Normanline/6*Beijing837(Zhouetal.,2005)。
 

陈新民等利用小麦品系70281(Normanline/3*Beijing837)与高感白粉病品种Chancellor配制杂交组合,构建了含有156个F2单株的分离群体,采用白粉菌系E15进行抗病性遗传分析,发现抗感植株符合3:1的分离比,表明抗病亲本70281中白粉病抗性是显性单基因控制的。

利用BSA法筛选与抗病基因Pm16连锁的多态性分子标记,发现4A染色体上的SSR分子标记与抗病性并不连锁,而5BS上的分子标记Xgwm159表现多态性且与抗病性连锁。

进一步筛选又找到2个与Pm16连锁的分子标记Xbarc004和Xbarc109,最终将抗白粉病基因Pm16定位在5BS染色体上,与最近的分子标记Xgwm159遗传距离5.3cM(Chenetal.,2005)。

鉴于Pm16和Pm30基因均来源于野生二粒小麦,定位在5BS染色体大体相同的遗传区间,与分子标记Xgwm159的遗传距离相似,对多个白粉病菌系具有类似的抗性反应(Wangetal.,2005),Xgwm159在含有Pm16和Pm30这两个基因的材料中无多态性,陈新民等推测Pm16和Pm30基因可能位于相邻或同一基因座位,但未能证明Pm16和Pm30是否为同一基因或等位基因。
 

关于Pm16基因分子标记定位结果与早期Reader和Miller利用中国春单体系进行染色体定位的不同,陈新民等做了深入的分析,指出可能的原因包括:(1)Reader和Miller的研究结果中5B单体的后代分离比15:1可能由于群体偏小,未能真实地反映5B单体的遗传特征,5B染色体也可能与抗病基因具有相关性(表1);(2)小麦染色体第4、5和7部分同源群存在易位的现象(Dvoraketal.,2018),5B染色体上含有抗白粉病基因Pm16的片段可能由野生二粒小麦4A染色体上易位而来;(3)Reader和Miller通过中国春单体定位法确定含有Pm16的染色体为4A,而单体材料由于在繁殖过程中存在单价体变迁,导致部分单体系并非含有最初的单体染色体,使得其定位结果不准确。

如抗白粉病基因Pm12(详见小麦抗白粉病基因Pm12介绍)和Pm24(详见小麦抗白粉病基因Pm24介绍)的单体定位结果都存在误差,之后利用分子标记更准确地进行了基因定位。
 

此外,西北农林科技大学硕士生李永强(指导老师何蓓如教授和贾继增研究员)用44对4A和5B染色体上的小麦SSR引物对杂交组合Pm16/7*北京837的101株BC7F2和Pm16/辽春10号的28株F2的抗感分离群体进行SSR位点检测,筛选到2个在抗感个体间存在多态性的SSR标记Xgwm335和Xgwm213。

遗传连锁图谱显示在两个分离群体中分子标记与抗病基因的遗传距离虽然不尽相同,但都能够将Pm16定位在小麦5B染色体上(李永强2004)。
 

4.问题与展望

在野生二粒小麦品系CL1060025中抗白粉病基因向普通小麦导入的过程中,所使用的普通小麦亲本为MarisNimrod和Norman,这两个品种对英国的优势白粉病菌已经丧失抗性,但都含有抗白粉病基因Pm2。

Reader和Miller在回交转育过程中使用了对Pm2基因具有毒性的白粉病菌系进行接种鉴定,确保了所获得的抗白粉病材料中的抗病基因为野生二粒小麦来源。

Pm2基因对我国的许多优势白粉菌系,尤其是很多研究中广泛使用的E09菌系具有抗性(详见小麦抗白粉病基因Pm2介绍)。

国内Pm16基因的遗传研究材料均未见针对其原始载体品种中Pm2基因的研究,在多个Pm16基因分子标记的研究中都发现白粉病抗性与分子标记Xcfd81紧密连锁,而Xcfd81是与Pm2基因紧密连锁的分子标记,不排除部分所用Pm16基因后代遗传材料中可能含有Pm2基因。

中国农业科学院植物保护研究所多年的多小种鉴定结果表明携带Pm16基因的小麦品种Brigand、携带Pm30基因载体品系Pm93-625-4或5P27、携带Pm2基因的小麦品种Ulka具有明显不同的抗谱(Wangetal.,2005;Lietal.,2009;Huaetal.,2009),以Brigand抗性最好,多年来几乎抗所有的白粉病菌系,这可能与其同时含有Pm16和Pm2两个抗白粉病基因有关;王竹林等所用的Pm30载体品系Pm93-625-4也抗当时20个鉴定所用的白粉菌系(Wangetal.,2005);另一个Pm30载体品系5P27抗性次之(Lietal.,2009;Huaetal.,2009);而携带Pm2基因的Ulka抗性稍差。

目前Pm2基因已经克隆,编码典型的NBS-LRR类抗病蛋白(Chenetal.,2019;Sánchez-Martínetal.2016),可以借助Pm2基因的功能标记明确这些抗病材料中是否存在Pm2基因。
 

Pm16和Pm30原始供体品系均源自于以色列的野生二粒小麦,含有Pm16的CL1060025来源于以色列中北部的撒玛利亚山脉(Samaria),而含有Pm30的C20来源于以色列北部的RoshPina(图2)。

从其采集地理位置来看,这两个基因的供体来源距离比较近,都位于野生二粒小麦的南部分布区,不排除二者具有血缘关系,或分别独立起源。

可惜的是Pm30基因的原始供体野生二粒小麦品系C20种子没有保存下来,近年也缺乏对该基因的进一步深入研究。

对于Pm16和Pm30的关系还需要进一步进行等位性检测、精细遗传定位、基因克隆和等位变异分析加以验证。
 

 

图2 小麦抗白粉病基因Pm16和Pm30的采集地

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