转录组+代谢组助力花青素积累研究

花青素(anthocyan),又称花色素,是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,在人体中起到抗氧化、抗突变、预防心血管疾病、保护肝脏和抑制肿瘤细胞的转移的作用,同时,植物中发现它在花药和果实的色素沉着,生物及环境胁迫响应等方面发挥重要功能。芜菁属于十字花科芸薹属二年生草本植物,是中国乃至整个东亚地区最重要的供人类食用和动物饲料的蔬菜作物之一。其富含丰富的膳食纤维,维生素C,大量的芥子油苷。带有紫色根皮的芜菁品种,倍受消费者喜爱,解析芜菁紫色根皮的形成原因,更有利于后期的育种研究。

近日,InternationalJournalofMolecularSciences发表了新疆农业科学院园艺作物研究所蔬菜栽培课题与百迈客关于芜菁花青素的合作文章,该研究利用转录组和代谢组测序数据,阐明了紫色和绿色芜菁中不同花色苷积累的机理。这为进一步深入分析芜菁块根根色形成,花色苷的调控机制提供了重要的理论基础。该文通讯作者为王浩研究员,第一作者为庄红梅助理研究员,在此再次恭贺新疆农业科学院园艺作物研究所团队产出如此优秀的成果!

文章:DifferentialRegulationofAnthocyaninsinGreenandPurpleTurnipsRevealedbyCombinedDeNovoTranscriptomeandMetabolomeAnalysis

杂志:InternationalJournalofMolecularSciences

IF:4.3

 

材料与方法

 

材料:紫色芜菁(PT);绿色芜菁(GT)

取样时期:苗期(S1,播种后15天),肉质根膨胀的早期(S2,播种后30天),肉质根的完全膨胀阶段(S3,播种后45天),肉质根的成熟阶段(S4,播种后55天),肉质根的收获阶段(S5,播种后65天)

取样部位:根皮

测序数据:转录组测序(IlluminaHiSeq2500平台);代谢组测序

结果验证:QRT-PCR

 

结果分析

 

01

转录组测序数据分析

通过对2个品种(GT,PT),5个时间点RNA-Seq数据分析,共产生了232.22Gbcleandata,每个样品平均产生6.20Gb,其中Q30达到了90.74%,使用Trinity软件对其测序数据进行组装,总共获得76152个unigenes,其中17594个unigenes的长度超过1kb。作者应用NR,Swiss-Prot,KEGG,COG,KOG,GO和Pfam数据库在内的各种数据库中对unigenes进行了功能注释,成功注释到了52,449个unigenes。基于FPKM的样本层次聚类显示了3个样本聚类,且与品种表现出明显的相关性,例如,聚类1主要为GT的样本,聚类2为PT的分组样本,聚类3有两个亚组,每个主要由独特品种的样本组成。这说明无论发育阶段如何,基因表达谱都是相当一致的,并且两个品种之间只有很少差异表达的基因可能与芜菁皮的着色差异有关。

 

 

02

差异表达转录组分析

作者对不同发育时间,品种间差异表达基因进行分析,以FC>2,FDR<0.01为标准,在S1,S2,S3,S4和S5发育阶段,分别检测到242、194、807、459和199个DEG。而S3时期的DEG明显高于其它时期,这可能意味着S3可能为芜菁着色的关键阶段。WRKY,MYB和bHLHTF在调节植物色素(类胡芜菁素-花青素)生物合成中发挥关键作用,S3阶段也检测到了较多的转录因子表达差异,其中c42189.graph_c1(WRKY)在PT的大多数发育阶段均下调,基因c33188.graph_c0(MYB),c44079.graph_c0(MYB)和c37493.graph_c0(bHLH)却呈现相反的趋势,推测这4个基因是芜菁根皮颜色形成过程中的主要调控基因。

图3差异转录因子分析

 

 

03

花色苷类化合物的检测

花青素是植物中最重要的类黄酮类色素。作者使用靶向代谢组学方法,分别在S1,S3,S4和S5处检测并确定了18、18、18和19种不同的花色素,得到了两种芜菁中21种独特的花色素苷化合物。将所有花色苷结合在一起的量后,PT根皮中花色素的含量是GT中的20倍。另外,在S3阶段检测到PT花青素含量是GT的20倍,进一步说明S3时期为根皮着色的关键时期。作者以VIP≥1和FC≥2或FC≤0.5为标准,检测两个芜菁之间的差异累积代谢物(DAM)。

在S1,S3,S4和S5分别检测到14、14、17和17个DAM,21种花青素至少在两个芜菁之间的一个发育阶段差异地积累。9种花青素在四个发育阶段,在两种芜菁中差异不断积累。

图4.差异代谢物分析 

 

04

类黄酮-花青素生物合成途径相关的差异基因和代谢产物的定位

为了预测导致两个芜菁品种出现根皮差异的分子机制,作者重建了类黄酮-花青素的生物合成途径。首先作者对DEGs中进行搜索,发现了4个基因即黄酮醇合酶[EC:1.14.11.23](c43941.graph_c0,FLS),二氢黄酮醇4-还原酶[EC:1.1.1.234](c39842.graph_c0,DFR),花色素苷合酶[EC:1.14.11.19]](c45741.graph_c0,ANS)和UDP-类黄酮葡萄糖基转移酶[EC:2.4.1.91](c48211.graph_c0,UFGT),这些酶主要参与软黄酮类-花色素苷生物合成途径。二氢黄酮醇是黄酮醇(通过FLS)和花青素(通过DFR)生物合成的主要基质。作者观察到PT中一个FLS不断下调,而在整个五个发育阶段中一个DFR的表达水平却显着上调,这表明PT倾向于优先考虑花青素。与DFR相似,在整个PT生长过程中,一种ANS表达水平却显着上调,表明花青素的高积累。作者在PT中发现了一个显着且不断上调的UFGT,显示出一种促进花色苷大量积累的机制。基于代谢物的检测和定量,作者确定PT中积累的紫色花青素主要是芍药苷O-己糖苷,花青素3-O-葡萄糖苷(kuromanin),天竺葵素,malvidin3,5-二葡萄糖苷(calvin),天竺葵素,天竺葵素3-O-β-D-葡萄糖苷(callistephinchloride)和花青素。GT的根皮中富含飞燕草素和矮牵牛花素3-O-葡萄糖苷,可以使根皮呈现绿色。

图5代谢通路模型分析

 

 

 

05

QRT-PCR验证及SNP检测

通过QRT-PCR,对RNA-Seq产生的4个候选结构基因和4个关键转录因子分析, 结果表明,PT的发育阶段基因c43941.graph_c0(FLS)和c42189.graph_c1(WRKY)明显下调,而基因c39842.graph_c0(DFR),c45741.graph_c0(ANS),c48211.graph_c0(UFGT),c33188.graph_c0(MYB),c44079.graph_c0(MYB)和c37493.graph_c0(bHLH)在PT的整个发育阶段均明显上调。因此,qRT-PCR结果与RNA-seq结果一致。作者检测了与花青素生物合成途径相关的四个差异表达的候选结构基因(c43941.graph_c0,c39842.graph_c0,c45741.graph_c0和c48211.graph_c0)的序列内的单核苷酸多态性(SNP),发现c39842.graph_c0(DFR)两个芜菁之间CDS 679nt处的存在无义突变(C/T)。SNP的GT等位基因深度(读取数)为0/51,PT为113,774/0。这表明诱导蛋白质终止密码子的等位基因T仅存在于GT中,而等位基因C显然仅存在于PT中。

 图6QRT-PCR验证及SNP检测

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