2019-11-07 22:53:20 热度:

《mSystems》发表国内首项儿童口腔微生物宏基因组的研究

传统病原微生物检测方法难以应对多种病原合并感染、未知或罕见病原感染的情况,基于高通量测序的宏基因组学技术给病原快速识别带来新的方法和思路。宏基因组测序技术是一种非培养的直接提取核酸进行测序分析,可以无偏向性的快速、广泛鉴定临床样本中细菌、真菌、病毒等微生物。近年来,越来越多的成功案例是基于宏基因组检测技术对临床病原菌进行检测,辅助临床精准治疗。多年深耕人体微生物组研究,基于多年的项目经验积累,快速研发了以原宏基因组技术(mNGS)为核心的病原微生物检测产品RealPathogen™,为医院和患者提供临床检验服务。截止目前,已和200余家三级医院的呼吸科、感染科、肿瘤科等临床科室展开项目合作。

 

在病原微生物检测的优势:

1、多年的项目经验积累,处理各种样品都得心应手

2、全面的病原数据库,检出各种病原微生物无遗漏

3、专业的分析团队,优化算法快速给出结果

 

下面跟着无创dna检测小编来看一下刚发表的一篇科研成果\(•◡•)/

 

2019年11月5日,锐翌基因与浙江大学医学院附属口腔医院在《mSystems》上合作发表科研成果《OralMicrobiomeAlterationsAssociatedwithEarlyChildhoodCariesHighlighttheImportanceofCarbohydrateMetabolicActivities》,创始人秦楠博士为通讯作者

 

导读

龋病是一种非常普遍的口腔疾病,严重影响人们的生活质量。2018年中国口腔健康流行病学调查结果显示,儿童龋病患病率较10年前明显上升了5.8%。因此,研究儿童龋病的发病机制,对儿童龋病的预防、筛查和早期干预具有重要意义。以往的研究表明口腔微生物在儿童龋病的发展中起着重要的作用。但是这些研究的方法(16SrDNA测序分析)在物种菌株水平和功能层面受限。本文我们使用宏基因组技术研究龋病和健康儿童的口腔微生物组成,结果发现其物种在不同的分类水平上和功能上有一定的差异。一些与龋病相关的物种此前未见报道,其中一些可能具有重要的临床意义。首次建立了龋病儿童的口腔微生物组基因目录,并揭示龋病发生的可能机制。结果表明,龋病与口腔微生物群落的改变有关,包括微生物组成和代谢功能的改变。

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文献ID

题目:OralMicrobiomeAlterationsAssociatedwithEarlyChildhoodCariesHighlighttheImportanceofCarbohydrateMetabolicActivities

译名:与儿童早期龋齿相关的口腔微生物组改变突出了碳水化合物代谢活动的重要性

发表期刊:《mSystems》 IF:6.519

发表时间:2019年11月5日 

通讯作者:邓淑丽、秦楠

检索:https://doi.org/10.1128/mSystems.00450-19

 

 

实验设计及技术路线

H2H:追踪调查,健康状态,6后月后仍保持健康;

H2C:追踪调查,健康状态,6后月后出现龋齿。

 

排除标准:(1)少于18颗牙齿的儿童;(2)在过去3个月内接受抗生素或氟化物治疗的儿童;(3)存在细菌感染或病毒感染以及一些系统性疾病的儿童。

 

入组25名严重龋齿和19名健康对照(45-73月龄)的学龄前儿童。根据国际龋病检测与评估系统II对儿童进行口腔健康评估。所有参与者的监护人均签署了知情同意书。本研究通过浙江大学医学院附属口腔医院伦理委员会审查。通过采集两组儿童唾液样本,液氮速冻,并-80℃保存。使用QIAampDNAminikit试剂盒提取DNA,进行宏基因组测序分析。

 

 

研究成果

1、龋齿儿童口腔微生物的变化

在门水平上,Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria在两个类群中含量最多(图1a)。在属水平上,两组的优势菌群主要是Neisseria、Prevotella、Rothia,Streptococcus、Veillonella、和Haemophilus(图1b),其中Prevotella是在龋齿(ECC)组中显著富集的,Nitrospira和Erysipelotrichaceaebacterium5_2_54FAA在健康组中显著富集(图1d)。在种水平上,Neisseriamucosa、Rothiamucilaginosa和Prevotellamelaninogenica是优势物种(图1c)。健康对照组中,Neisserialactamica或Streptococcusaustralis显著富集(图1e)。相反,在ECC组中发现20个种水平物种显著富集,已有文献报道Streptococcusmutans和multiplePrevotellaspp.与龋齿有关,Prevotellaamnii、Shuttleworthiasatelles、Olsenellauli和Anaeroglobusgeminatus与疾病的关系尚未见报道。

 

为了进一步描述ECC相关唾液微生物组的特征,基于26264个差异的基因在样本间丰度的相关性进行聚类,形成18个MGS,其中12个MGS在ECC中显著富集,6个在健康对照组中显著富集。在ECC组富集的12个MGS中,有4个隶属于Prevotella。隶属于Neisseria的两种细菌在健康受试者中显著富集。重要的是,这些基于MGS的结果与物种分类分析的结果⼀致(图1d和图1e)。

 

图1健康对照和龋齿儿童口腔微生物的相对丰度

 

2、ECC和健康组菌株水平微生物的变异

微生物菌株组成差异和菌株水平的变化是决定微生物群落功能的关键因素。基于StrainPhlAn软件研究健康对照组与ECC组菌株水平的差异,我们从样本中构建了具有足够覆盖度和可用参考基因组物种的系统发育树。研究结果发现,ECC组和健康组之间存在着相当大的菌株水平异质性,例如Actinomycesodontolyticus和Actinomycesgraevenitzii。龋病儿童相比于对照组,其A.odontolyticus中的菌株在进化树上与A.odontolyticus F0309、A.odontolyticusATCC17982和A.odontolyticusXH001更接近(图2a)。对于A.graevenitzii,龋齿儿童中的菌株在进化距离上更接近于与A.graevenitziiC83和A.graevenitziiUMB0286,而健康对照组则与与A.graevenitziiC83和A.graevenitziiUMB0286(图2b)。

 

图2ECC和健康对照口腔A.odontolyticus(a)和A.graevenitzii(b)菌株水平的进化树分析

 

3、ECC和健康组唾液微生物群落网络互作分析

使用共现网络分析口腔微生物群落在健康和ECC条件下的互作模式。基于相关性系数和P值调整后的FDR值推断微生物群体的互作关系,ECC组展示了150个显著富集的物种的282个互作关系(图3a),健康对照组展示了164个物种的374个互作关系(图3b)。比较两个网络图的特征,发现健康组网络的节点亲密度明显高于ECC组网络。ECC和健康对照组中分别有一个和两个大于10个节点的簇。健康组中两个簇的主要菌分别为Bacteroidesspp.和Prevotellaspp.,而ECC组则是Streptococcusspp.和Prevotellaspp.。

 

图3健康对照和ECC口腔微生物互作的网络分析

 

4、龋齿和健康对照的功能组成

基于KEGG和eggNOG数据库对ECC和健康对照的口腔微生物菌群进行功能注释和差异分析。结果显示两组在各种功能/途径上存在广泛差异,ECC组碳水化合物的代谢增加,翻译水平、能量代谢、辅酶/辅助因子/维生素代谢和信号传导均降低(图4a和4b)。ECC组和健康对照组在KEGG第三级的功能组成也存在一些差异。例如在膜转运途径中,ECC患儿的磷酸转移酶系统显著富集(图4c)。在碳水化合物代谢途径中,柠檬酸循环(三羧酸[TCA]循环)在健康对照组中显著富集,糖酵解/糖异生在ECC组中显著富集(图4d)。

 

图4健康对照组和ECC组中富集的KEGG功能基因和eggNOG功能基因

 

5、基于口腔微生物群的ECC监测模型

利用mRMR算法,选取7个物种标记构建支持向量分类器,该分类器判别龋齿的性能最佳(图5a)。其中5个种(Streptococcusmutans、Prevotellaamnii、EubacteriaceaebacteriumACC19a、Shuttleworthiasatelles和Dialisterinvisus)在ECC组中显著富集,CandidatusNitrospiradefluvii和Erysipelotrichaceaebacterium在健康对照组中显著富集(图5b)。该分类器的AUC曲线下的面积为98.53%,95%置信区间(CI)为95.81%到100%(图5c)。值得注意的是,H2C亚组的这7个标记物的相对水平均表现出趋近龋齿组的趋势(图5d)。基于该模型预测19名健康对照者未来ECC发病的情况,结果表明该模型能够预测龋病的发病情况,且性能较好(AUC78.33%)(图5e)。

 

图5区分健康对照和ECC的分类模型

 

 

讨论

龋齿是世界范围内的口腔问题,影响着很大比例的成年人和儿童。口腔微生物群落在人类健康中起着至关重要的作用,可以深刻地影响包括龋齿在内的许多疾病的发展。本研究采用44例儿童口腔唾液进行宏基因组测序,构建了2,200,443个基因的龋齿基因集。ECC儿童和健康儿童的口腔微生物组成及其功能有差异,在ECC组中显著富集的微生物Prevotellaamnii、Shuttleworthiasatelles、Olsenellauli和Anaeroglobusgeminatus尚未被报道,其中Prevotellaamnii属于Prevotella属,大多数被报道与龋齿有关,并可能具有蛋白水解/氨基酸降解活性。Shuttleworthiasatelles、Olsenellauli和Anaeroglobusgeminatus存在于口腔,并与牙周病相关。这类微生物在口腔中的环境有助于龋齿的发生。健康对照组的N.lactamica和Streptococcusaustralis含量高于龋齿儿童,说明这两种微生物与牙齿健康有关。此研究结果不仅证实先前口腔微生物群与龋病之间关系的发现,而且还发现了ECC新的潜在的生物标志物。

 

基于StrainPhlAn软件分析检测到ECC和健康对照组Actinomycesodontolyticus和Actinomycesgraevenitzii在菌株水平上差异显著,种水平上无显著差异。ECC和健康对照组的微生物网络互作模式不同,健康状态下,网络互作主要是拟杆菌属和普氏杆菌属,ECC状态以链球菌属和普氏菌属为主。

 

健康对照组和ECC组中口腔微生物的功能组成有差异,ECC组与碳水化合物代谢相关的功能显著富集,表明碳水化合物活性增高是促进龋齿的一个因素。在膜转运途径中,ECC患儿的磷酸转移酶系统显著富集,说明ECC组中跨膜转运和磷酸化更活跃。在碳水化合物代谢途径中,健康儿童的柠檬酸循环(TCA循环)显著富集,而ECC组的糖酵解/糖异生作用强,提示糖的厌氧代谢在龋齿儿童口腔内更为活跃。在功能模块层面,ECC组AI-2转运系统、PTS系统、糖醇/山梨醇特异性II组分、核苷酸糖生物合成等显著富集。群体感应是龋齿形成过程中生物膜形成的重要机制,有报道称细菌间相互作用涉及信号分子自诱导因子-2(AI-2)。虽然AI-2在某些微生物中是群体信号的组成部分,但在其他物种中,该蛋白也具有不同的活性,这些活性可能与龋齿的发生有关。ABC转运蛋白和双组分信号转导系统(TCS)根据局部环境变化调节基因表达,进而影响细菌的生存能力和毒力。此外,抑制细菌的运动可以促进生物膜的形成,ECC组细胞运动模块的显著减少可能是由于ECC组生物膜形成的增加导致的。

 

最近的研究表明,幼儿缺铁是ECC的危险因素,这一发现在动物实验中得到了证实。我们的数据显示,铁复合转运在无龋儿童中是一个丰富的功能,这与之前的结果一致。健康组比龋齿组更丰富的其他转运模块包括硫酸盐转运、腐胺转运和微霉素C转运途径。有研究表明,转运蛋白活性降低可能导致代谢化合物(如糖和酸)的积累,从而导致龋齿。

 

基于这些结果,文章提出一个模型来解释一些微生物在龋病发病中的作用(图6)。众所周知,牙菌斑生物膜从碳水化合物中产生酸,导致龋齿的发生。蛀牙的发展是一个渐进的过程,第一阶段的特征是口腔生物膜的形成和细菌黏附。致龋细菌,如变形链球菌,产生合成胞外多糖的GTF。EPSs,尤其是水不溶性葡聚糖,在牙菌斑的形成和生物膜的稳定性中起着关键的作用,因为这些分子允许致龋细菌附着在牙釉质表面。生物膜表型受其密度依赖的群体感应系统调控,该系统主要由能力刺激肽(CSP)和双组分信号转导系统(TCS)组成。除了生物膜的形成外,CSP介导的QS系统还影响其产酸性和酸性。PTS系统负责水溶性葡聚糖的识别、跨膜转运和磷酸化。当糖被频繁消耗时,糖酵解和酸化就会随之而来。F-typeHATPase和伴侣蛋白能增强致龋细菌的产酸性和耐酸性。在产酸阶段,产酸和耐酸的细菌迅速繁殖,再矿化平衡倾向于净矿物质流失,导致龋齿。在耐酸阶段,更多的耐酸细菌如变形链球菌和乳酸菌成为优势菌,加重症状。因此,环境酸化是造成龋齿发展的主要因素。

 

综上所述,宏基因组结果显示健康学龄前儿童和龋齿儿童口腔微生物在不同的物种分类和功能水平存在差异。其他微生物群相关研究表明,了解这些复杂而微妙的关系对预防和治疗疾病至关重要。为了更好地了解微生物在龋病发展中的作用,宏转录组分析可能为阐明口腔微生物群落中分类学和功能变量的作用提供额外的证据。

 

图6龋齿儿童口腔菌群的分类特征与功能组成特征

 

 

研究结论

1、首次构建了龋病儿童的微生物组基因目录;

2、学龄前龋齿儿童与健康儿童在口腔微生物群和功能方面存在差异;

3、Prevotellaspp.和Veillonellaspp.与龋齿相关,龋齿儿童与无龋儿童之间潜在的功能差异主要分布在碳水化合物代谢功能/途径上;

4、构建了一个由7个物种组成模型用来预测龋齿的发生。

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