2020-02-05 16:22:48 热度:

我们如何测试新型冠状病毒?详解

这一篇给大家带来的主题是“新型冠状病毒



测试我们之前从未见过的病毒背后的生物学缺陷。

由于最近发现的冠状病毒已迅速扩散到其起源地之外的中国,世界各地的卫生当局都需要快速发展测试能力。

在美国,该任务已由疾病控制中心(CDC)完成,该中心已发布了其方法,目前正在申请紧急豁免,以允许医学检验机构进行这些检验。

进一步阅读,这是武汉新颖的冠状病毒爆发的最新消息但是,如果您不熟悉分子生物学的工具,那么CDC的测试程序也可以用另一种语言编写。

接下来是对如何在不到一个月的时间内从未知病毒进行诊断测试的描述。

从无到有当中国卫生部门首次面对疫情时,人们对此感到不安。

在2000年代初期的SARS爆发期间,已经处理了类似的症状,并且十年后看到了MERS的蔓延。

由于有了这些病毒和相关病毒,早在2005年就已经对典型冠状病毒基因组的结构进行了详细描述。

这些知识无疑将证明对开发快速诊断测试的第一步至关重要:新病毒基因组的表征病毒,2019-nCoV。



因为我们知道普通冠状病毒的外观,所以我们已经能够确定在该病毒家族的新成员的进化过程中变化不大的区域。

这样一来,我们无需先分离病毒即可获得其基因组序列。

冠状病毒基因组测序的第一个挑战是它是由RNA而不是DNA制成的。

我们处理核酸的大多数工具都是DNA特有的。

幸运的是,我们发现了一种叫做“逆转录酶”的酶,它吸收RNA并产生DNA的拷贝。

转录是将DNA复制到RNA中。

这种酶的作用相反,因此得名。

(逆转录酶是在其他RNA病毒中首次发现的,需要将其复制到DNA中作为感染的一部分。

)使用逆转录酶,研究人员能够制作2019-nCoV部分的DNA副本,作为研究其基因组的第一步。

但是,从受感染的个体中提取样品的反转录只会简单地从所有存在的东西中产生一堆DNA片段:病人自己的细胞,无害细菌等。

幸运的是,DNA测序和分析技术已经变得如此先进,以至于现在可以对整个混乱,无关的事物以及所有事物进行测序,并让计算机对现存的信息进行排序。

该软件能够获取我们对普通冠状病毒基因组的了解,并识别所有看起来像冠状病毒的序列片段。

其他软件可以确定所有这些片段如何重叠,然后将它们缝合在一起,从而产生接近完整的冠状病毒基因组。

在这一点上,中国卫生当局认识到与这些感染有关的病毒是新病毒,就迅速发布了该病毒的基因组序列,以便可以准备其他卫生组织。



从基因组到采样为了进行针对2019-nCoV的诊断测试,研究人员必须寻找其基因组区域,这些区域在冠状病毒进化过程中不会快速变化,但是在该家族的这一分支中变化足够大,因此可以将其视为其独特的特征。

这些序列可用于设计一种方法,使用一种称为聚合酶链反应(PCR)的技术扩增2019-nCoV基因组片段。

我们不会涉及PCR如何工作的所有技术细节,部分原因是我们已经这样做了。

为了理解诊断测试,您需要知道的是,您需要设计两个小片段DNA,它们与基因组的两个部分相匹配(意味着它们可以与之碱基配对),相距几百个碱基对。

这些小的DNA片段称为“引物”。

PCR将扩增两个引物之间的DNA片段。

它是通过在复制DNA的酶存在下使DNA经过加热和冷却循环来实现的。

每次循环,这些酶均可在引物之间形成两个新的拷贝。

使用此过程,可以提取极其罕见的一段DNA,并产生数十亿个拷贝。

但是PCR可与DNA一起使用,而冠状病毒则由RNA制成。

因此,在尝试进行PCR之前,我们需要先使用逆转录酶。

幸运的是,公司已经开发出了解决方案,其中包含了两个反应都需要的所有酶和原料,从而可以实现逆转录-PCR反应混合物的混合。

反应的组合被称为RT-PCR。

使用正确的引物,RT-PCR可以使我们从混乱的混合物或RNA开始,并为我们留出许多特定片段的2019-nCoV拷贝,前提是原始样品中存在任何拷贝。

问题在于,PCR如此灵敏,以至于它还可以放大较小的错误,即引物附着在远距离相关的序列上,样本中远距离相关的冠状病毒,甚至污染先前的样本。

即使这些错误很少见,PCR所提供的指数扩增最终仍可以使样品占主导地位。

幸运的是,人们已经设计出一种方法来利用这些错误的稀有性。

变得真实如果存在正确的引物序列(即样品中存在2019-nCoV),则扩增通常会从第一个循环开始并迅速增长。

相反,错误可能需要几个周期才能发生,因此放大会滞后一会。

为了弄清楚什么时候真正存在2019-nCoV,我们必须确定放大何时快速发生以及何时延迟。

我们必须实时观察PCR循环的进度。



为此,科学家开发了一种仅在存在双链DNA的情况下才发出荧光的染料。

随着反应开始,几乎没有反应,因此荧光很低。

但是,随着更多扩增的发生,辉光会迅速上升,直到有太多的DNA使得检测循环之间的差异变得不可能。

如果放大提早开始,则这种上升和饱和会提早发生。

如果它取决于错误,则需要更长的时间才能看到它们。

因此,实时RT-PCR(RRT-PCR,对于那些对行话感到兴奋的人)提供了一种确定是否存在PCR扩增的方法,因为存在我们感兴趣的序列。

(它也可以用来估计存在该序列的相对数量,但是此测试不需要。

)由于这是一项非常重要的技术,因此公司已基于该技术开发了产品。

您可以购买荧光染料,酶等,以及一台集成了热硬件以循环反应并具有光传感器以监视荧光的机器。

套件不是您所需要的但是,如果您查看CDC的说明,则几乎没有关于硬件或酶的讨论。

相反,您将找到避免污染的方法的讨论。

如果设施正在进行大量的样品测试,那么样品和之前的PCR反应都将不乏2019-nCoVDNA。

鉴于PCR可以轻松扩增稀有序列,这会带来成群的假阳性风险。

因此,CDC详细介绍了一系列最佳实践,例如使用与用于处理样品的硬件不同的另一套硬件来准备RT-PCR反应混合物。

另一大部分说明涉及适当控件的细节。

为了确保污染不会产生假结果,其中一些忽略了酶或样品RNA等关键反应成分。

这将告诉您是否应该信任积极的结果。

还有一个积极的控制,以确保反应混合没有问题,从而告诉您是否可以相信负面的结果。



也就是说,测试不会是确定的。

我们对病毒的生命周期知之甚少,还无法了解感染的动态:感染后多久才可检测到病毒,以及何时与症状发作相比。

无症状感染的人很有可能没有足够的病毒来进行此项检测以持续感染该病毒。

因此,疾病预防控制中心仍建议对被认为有感染风险的人保持谨慎。

不过,由于在中国以外的人与人之间传播的病例似乎越来越多,因此无需将样品运送到亚特兰大疾病预防控制中心的检测工作可以大大有助于我们应对迅速变化的疫情的能力。

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