2019-11-20 01:42:21 热度:

RNA-seq数据分析文献15-circRNAseq + qPCR

 

导读

 思路:样本收集及RNA测序-->差异表达circRNA鉴定-->circRNA-miRNA互作关联分析-->qRT-PCR验证-->临床数据分析。图表:circRNA差异火山图、散点图,基因组圈图,circRNA表达热图、散点图,互作网络图;差异circRNA列表,临床相关性统计表等。

摘要

 背景:环状RNA(circRNA)是一类内源非编码RNA,在基因调控中具有重要作用。患有3级子宫内膜癌(EC)的患者预后普遍较差,且尚不清楚circRNA在3级EC中的具体作用。这项研究旨在调查circRNA在3级EC中的作用。

方法:使用RNA测序分析了两名3级EC患者的癌组织及邻近非癌性子宫内膜组织中的circRNA的表达谱。生物信息学分析用于研究差异表达的circRNA,并使用qRT-PCR验证。circRNA和microRNA(miRNA)的相关网络分析用于描述circRNA-miRNA的相互作用。

结果:共计75928个circRNA存在显著的表达变化,hsa_circ_0039569具有hsa-miR-542-3p和hsa-let-7c-5p的MRE,qRT-PCR验证了3级EC中hsa-miR-542-3p和hsa-let-7c-5p的下调。在临床病理参数中,hsa_circ_0039569的表达水平与肿瘤分化程度显著相关。(7万多个circ显著改变,作者不怀疑分析方法吗)结论:本篇是证明3级EC组织和相邻的非癌性子宫内膜中circRNA表达存在诸多差异的第一项研究,为3级EC的诊断和临床治疗提供新的分子候选物。

前言

 子宫内膜癌(EC)是女性常见的妇科恶性肿瘤,3级EC患者的预后普遍较差。circRNA在细胞分化、组织稳态以及疾病的发展中起重要作用,在癌症中,circRNA具有用作临床诊断标志物和治疗靶标的潜力。迄今为止,对3级EC的circRNA潜在调控机制知之甚少。本篇研究对3级EC的circRNA转录组进行分析,检测差异表达circRNA,并进一步分析了相关miRNA。差异表达的circRNAs可能成为3级EC预后诊断治疗的潜在生物标志物。

方法

 

 

在暨南大学附属第一医院获得EC手术患者的肿瘤与癌旁组织,用于circRNA测序分析及qRT-PCR验证。ClusterandTreeView用于circRNA表达的分层聚类分析,使用Arraystar基于TargetScan和miRanda预测circRNA-microRNA的相互作用。

结果

 

1   鉴定差异表达的circRNA

在两对样品中总共检测到75928个circRNA靶标,并对3级EC和相邻非癌组织的circRNA表达谱进行差异表达分析。结果显示了circRNA的差异表达分布(图1、2)。

图1,患者中3级EC和邻近非癌性子宫内膜组织中差异表达的circRNA。(A)散点图显示了相邻非癌性子宫内膜(Y轴)与3级EC组织(X轴)之间circRNA的变化;(B)火山图显示了3级EC和邻近非癌性子宫内膜组织中circRNA的差异表达;(C)样本中circRNA表达分布;(D)circRNA类别,大多数源自内源基因转录,少数为基因间转录的。

图2,差异表达的circRNA在各样本(人)染色体中的分布。

 

2   在3级EC和邻近非癌性子宫内膜组织中鉴定差异表达的circRNA

差异表达circRNA的聚类热图显示,3级EC组织中circRNA的表达与非肿瘤组织显著不同。总计62167个独特的circRNA存在显著的表达差异(P<0.05),包括25735个上调和36432个下调(图3)。

图3,差异circRNA的表达热图。(A)所有差异circRNA的层次聚类分析;(B)top10上调和下调circRNA的层次聚类分析。

3   circRNA-miRNA相互作用网络以及circRNA-miRNA关联的预测

考虑到circRNA具有作为miRNA海绵调节基因表达的潜力,因此对circRNA的ceRNA功能进行了进一步的探索。基于Arraystar的碱基配对规则,使用TargetScan和miRanda数据库预测了所有差异表达的circRNA的靶标miRNA,共得到451个miRNA(图4)。

 

图4,circRNAs-miRNAs互作网络图。红色(上调)和黑色(下调)节点代表circRNA,蓝色节点代表miRNA。

 

 

4   circRNA差异表达水平的验证

使用qRT-PCR在其它30例患者样本中验证了6个circRNA(hsa_circ_0039569、hsa_circ_0001523、hsa_circ_0001610、hsa_circ_0000437、hsa_circ_0001776和hsa_circ_0009043)的表达,证实先前获得的差异表达circRNA是可靠的(图5)。

图5,实时定量PCR验证六种circRNA的表达。

 

5   30例患者hsa_circ_0039569的表达与临床特征的关系

qPCR结果表明,hsa_circ_0039569在3级EC中的表达更高。通过分析hsa_circ_0039569与样本来源患者的临床病理数据之间的相关性,表明hsa_circ_0039569的表达水平与患者年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、FIGO分期、肌层浸润、肿瘤分化等显著相关(表6)。

 

6   circRNA-miRNA关联的预测

基于circRNA-miRNA轴,显示hsa_circ_0039569与3级EC的癌症相关途径相关。通过预测hsa_circ_0039569-miRNA的相互作用,鉴定到靶标miR-542-3p和hsa-let-7c-5p。TargetScan和miRanda分析显示hsa_circ_0039569与miR-542-3p和hsa-let-7c-5p具有相对完美的匹配序列。

图6,TargetScan和miRanda预测了hsa_circ_0039569与hsa-miR-542-3p(A)或hsa-let-7c-5p(B)之间的相互作用。

 

qRT-PCR进一步验证了hsa-miR-542-3p和hsa-let-7c-5p的表达上调(图7)。Spearman相关分析显示hsa_circ_003956与hsa-miR-542-3p和hsa-let-7c-5p呈负相关(图8)。

图7,实时定量PCR验证两个miRNA的表达。

图8,hsa_circ_003956与hsa-miR-542-3p和hsa-let-7c-5p之间表达的Spearman相关性。

讨论

 

本篇研究首次揭示了3级EC的circRNA表达特征。鉴定的差异表达circRNA以及circRNA-miRNA关联预测可为3级EC诊断和治疗提供新见解。

 

 AnalysisofthecircularRNAtranscriptomeinthegrade3endometrialcancer

3级子宫内膜癌中circRNA转录组的分析

 

期刊:CancerManagRes影响因子:2.243发表单位:暨南大学附属第一医院

RNA-seq数据分析文献qPCRcircRNAseq

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RNA-seq数据分析文献1 - 中医 -RNAseq - 简单验证
RNAseq纯数据分析发文章,能否做了个RNAseq,或者蛋白组学,代谢组学,通过数据分析,或者简单的实验验证,即可发表一篇小文章呢。当然是可以的。 这类文章,大约分为三种: 1.只做RNAseq,比如mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA、甚至全转录组测序,通过纯数据分析,发表文章; 2.做了RNAseq,同时结合公共资源数据的分析,比如来源于GEO/TCGA等的分析; 3.做了RNAseq,做了数据分析,同时做qPCR/WB/免疫组化等小实验,加以验证,发文章。 导读 本篇文章,做了RNA...[详细]
2019-11-13
RNA-seq数据分析文献2 - 基因敲除 -RNAseq
除去准备实验模型不算,本篇是一个RNAseq实验,写了一篇文章。思路:实验处理--RNA-seq和差异基因分析--差异基因富集分析;图表:研究背景和实验处理图、火山图、热图、GO富集结果、GO散点图;差异基因表,附加材料为实验处理图,RNA-seq定量结果表。 摘要 本篇文章中,作者主要通过将GRL敲除后斑马鱼的RNA-seq数据研究目的基因的通路和下游基因。 前言 本部分作者阐述了研究基因和动物材料相关的内容。 方法 动物材料和预处理 本部分作者详细介绍了研究所用的动物材料和CRISPR/Cas9敲除的...[详细]
2019-11-13
RNAseq纯测序分析文章整理说明
近几年,RNAseq测序价格极大降低,许多老师大量的做RNAseq。RNAseq是对样品中的totalRNA提取并进行高通量测序,通过分析获得各类分子的表达量。通过对照组与处理组等比较得到差异表达的基因,并对差异基因进行如GO/KEGG富集,了解处理因素影响的生物学过程、通路等。 RNAseq是RNA分子测序的总称,常见的有mRNA测序,miRNA测序,lncRNA测序,circRNA测序,也可以全部测序,称为全转录组测序。 这几类测序都需要先获得样品的totalRNA,根据所需要分子的不同。可以对各类分...[详细]
2019-11-12
  • RNA-seq数据分析文献23-基因敲除RNAseq-qPCR
    导读 思路:基因敲除--RNA-seq与差异基因分析--差异基因功能富集;图表:差异基因火山图、热图、功能富集气泡图;qRCR引物表、RNA质控数据表、差异基因表、GO和KEGG通路富集表; 摘要 本文是一篇基因敲除小鼠的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究ABCG1基因的功能及其下游基因和通路。摘要部分作者从目的、方法、结果、结论四个方面对该研究做了简述。 前言 背景部分作者介绍了关于胆固醇代谢与动脉粥样硬化,ABCG1的已研究的功能等相关内容。 方法 动物和饮食 、 PBMC...
  • RNA-seq数据分析文献29 - 狗前列腺RNAseq-4.011
    导读 思路:实验前处理--RNA-seq与差异基因分析--通路富集分析;图表:RNA-seq质控图、Venn图、PCA图、差异基因热图;实验对象信息表; 摘要 本文是一篇犬前列腺癌样品的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究超声引导下细针穿刺活检的检测能力。 前言 背景部分介绍了犬前列腺癌的传统检测方法和本研究的目的。 结果 1 实验对象 本部分介绍了本实验的实验对象和检测结果。 2 RNA数量 在来自41只狗的42个US-FNA样本,来自31只狗的31个PM-FNA吸出物和来自4...
  • RNA-seq数据分析文献25-RNAseq+蛋白组学-4.183
    导读 思路:细胞系溶菌酶处理--RNA-seq与差异基因分析--功能富集--蛋白组学分析;图表:实验流程图、差异基因功能图、火山图、热图、基因富集图、互作分析图;差异基因表、基因功能富集表、蛋白质组学定量结果表; 摘要 本文是一篇单核细胞系样品的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究溶菌酶对单核细胞基因表达量的差异。 摘要部分介绍了溶菌酶的功能和实验流程。 前言 背景部分作者介绍了溶菌酶的生物学功能和临床应用,指出其与免疫细胞互作的分子机制尚未发现。 结果 在用溶菌酶处理1小时结束...
  • RNA-seq数据分析文献2 - 基因敲除 -RNAseq
    除去准备实验模型不算,本篇是一个RNAseq实验,写了一篇文章。思路:实验处理--RNA-seq和差异基因分析--差异基因富集分析;图表:研究背景和实验处理图、火山图、热图、GO富集结果、GO散点图;差异基因表,附加材料为实验处理图,RNA-seq定量结果表。 摘要 本篇文章中,作者主要通过将GRL敲除后斑马鱼的RNA-seq数据研究目的基因的通路和下游基因。 前言 本部分作者阐述了研究基因和动物材料相关的内容。 方法 动物材料和预处理 本部分作者详细介绍了研究所用的动物材料和CRISPR/Cas9敲除的...
  • RNA-seq数据分析文献17 - siRNA - RNA-seq
    导读 思路:实验处理(干扰RNA)和实验验证--RNA-seq和差异基因分析--功能富集分析--验证下游基因; 图表:实验处理图、火山图、PCA图、通路富集图、Venn图、qPCR结果图、实验验证图;附加材料为差异基因表和实验验证图。 摘要 摘要部分作者根据之前的研究发现JAK1基因的重要作用,介绍本研究的主要内容。 前言 背景部分作者介绍了未折叠的蛋白质反应(UPR)的研究背景和JAK家族的功能。 方法 RNA测序和生物信息学 通过Qubit荧光计定量RNA。 通过BioanalyzerNano芯片评估...
  • RNA-seq数据分析文献6 - TCGA数据分析
    导读 思路:公共数据收集--RNA-seq和差异基因分析--互作网络分析及模型构建。 图表:常规柱形图、散点图、箱线图、森林图等统计图;相关图、互作网络图、基因表达热图、生存曲线图等。 摘要 背景: 尿道膀胱癌(BLCA)是世界范围内最常见的预后不良的恶性肿瘤之一。 这项研究旨在探索有效的预后生物标志物,并建立BLCA患者的预后风险评分模型。 方法: 基于从癌症基因组图谱数据库中检索到的RNA-Seq数据,通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)确定与BLCA病理阶段相关的共表达模块。 通过Cox比例风险...
  • RNA-seq数据分析文献22-差异基因与临床数据相关性分析
    导读 思路:实验处理--RNA-seq和差异基因分析--qPCR和免疫染色验证;图表:实验处理图、热图、实验验证图;差异基因表、差异基因相关性分析表,附加材料为RNA-seq定量结果表、GO富集结果表。 摘要 本文是一篇人牙周样品的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究吸烟对牙周膜基因表达量的差异。摘要部分作者以背景、方法、结果、结论四个方面对该研究做了简述。 前言 背景部分介绍了吸烟对牙周膜的有害影响的研究背景,指出其通路机制尚未清楚。 方法 研究设计和研究人群 招募了牙周和全身...
  • RNA-seq数据分析文献21-公共数据WGCNA分析-5.515
    Comprehensivetranscriptomicanalysisindicatesbrainregionalspecificalterationsintype2diabetes 全面的转录组分析表明2型糖尿病的大脑区域特异性改变 期刊:Aging(AlbanyNY)影响因子:5.515发表单位:北京大学健康科学中心基础医学院 导读 思路:GTEx数据收集--差异表达基因分析,GO、KEGG功能富集分析--基因共表达分析,网络特征、T2D相关模块及中枢基因的识别。图表:统计类如柱形图、提琴图、散点图,...
  • RNA-seq数据分析文献18-RNAseq纯分析-3.634​
    导读 思路:实验处理(压力+睡眠剥夺PSD)--RNA-seq和差异基因分析--GO富集分析和互作网络分析;图表:实验处理流程图、热图、Venn图、GO富集图、互作网络图;附加材料为RNA-seq定量结果表,GO富集结果表。 摘要 本部分主要为背景和结果的概述。 前言 背景部分主要介绍了垂体调节睡眠的相关背景。 方法 RNA提取和纯化 整个垂体样品(n=3-4/组)在室温下用装有22号规的1-mL无菌注射器在500LRiboZol(AMRESCORiboZolRNA提取试剂,VWR,Radnor,PA,美...
  • RNA-seq数据分析文献8
    导读 思路:公共数据收集--蛋白质-RNA互作模型分析及验证--motif分析。图表:常规柱形图、散点图、箱线图、热图、韦恩图等统计图;motif图等。 摘要 通过剪接、转运、翻译和降解,基因表达的转录后水平受到严格调控。RNA结合蛋白(RBP)在转录后基因调控中起关键作用,RBP-RNA相互作用的遗传变异影响基因产物和功能。本篇研究开发了一种计算方法,ASPRIN(等位基因特异性蛋白质-RNA相互作用),通过CLIP-seq和RNA-seq数据的联合分析,观测CLIP-seq中RBP等位基因偏好(与RN...