2019-11-22 13:20:52 热度:

RNA-seq数据分析文献23-基因敲除RNAseq-qPCR

导读

 

 

思路:基因敲除-->RNA-seq与差异基因分析-->差异基因功能富集;图表:差异基因火山图、热图、功能富集气泡图;qRCR引物表、RNA质控数据表、差异基因表、GO和KEGG通路富集表;

摘要

 本文是一篇基因敲除小鼠的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究ABCG1基因的功能及其下游基因和通路。摘要部分作者从目的、方法、结果、结论四个方面对该研究做了简述。

 

前言

 背景部分作者介绍了关于胆固醇代谢与动脉粥样硬化,ABCG1的已研究的功能等相关内容。

方法

 动物和饮食PBMC分离和总RNA提取本部分作者介绍了实验对象的前处理和RNA提取过程。

RNA-seq分析RNA片段的长度由Agilent2100生物分析仪(Agilent,USA)检测。然后使用PCR扩增构建cDNA文库。RNA序列是由Illumina第二代高通量测序平台通过PE150测序策略进行的。然后读取劣质的读物或过滤出衔接子。使用Tophat2和Cufflinks软件处理干净的读取数据,以分别完成转录组的比对和转录剪接分析(Ghosh和Chan,2016)。

差异表达基因分析(DEG分析)外显子模型每千碱基对片段的每千个图谱读取片段数(FPKM)是最常用的测量基因表达水平的方法(Mortazavi等,2008)。使用联合作为计数模型,通过HTSeq软件(美国普林斯顿大学)分析每个样品的基因表达水平。我们使用FPKM>1的cutoff值来定义基因表达。DEG分析使用DESeq(Anders和Huber,2010)(美国生物导体公司)进行。筛选具有差异表达的基因,并进行层次聚类分析。

基因本体论(GO)分析GO数据库是国际标准化的基因功能分类系统,分为分子功能,生物学过程和细胞成分三大类。GO分析由GOseq(Young等,2010)(美国Bioconductor)进行。计算GO项的p值和p值(q值)的错误发现率(FDR),以找出与差异表达基因最相关的GO项。

6 京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析使用KEGG数据库(Kanehisa等,2008)(KanehisaLaboratories,日本)进行途径富集分析。Fisher精确检验用于确定不同表达基因中最重要的富集途径。

结果

 

1  测序数据质量控制

测序数据的质量控制如表2所示。去除质量较差的原始读数后,每个样品中的干净碱基数超过3G,单个碱基的测序错误率低于1%。每个样品的Q20和Q30均>90%。找不到GC偏差。(注:RNA-seq质控整体数据概述)

 

2   DEG识别

与野生型对照相比,ABCG1基因敲除组差异表达605个基因,q值<0.005,包括306个上调基因和299个下调基因(图1)。层次聚类分析表明,605个DEG中的某些基因组可能具有相似的功能或参与同一途径的调控(图2)。在这些DEG中,有54个参与代谢调节,其中13个与脂质代谢有关(表3)。另外,有21个基因与吞噬作用和胞吞作用有关。其他一些基因与细胞粘附,白细胞跨内皮迁移和细胞因子-细胞因子受体相互作用有关(表3)。(注:差异基因的整体概述和聚类分析)

图1DEGs火山图。水平轴代表每个样品中差异基因表达的倍数变化。纵轴代表差异基因表达水平的统计学意义。与野生型对照相比,那些表达水平被上调的基因用红点表示,而那些表达水平被下调的基因则用蓝点表示。该图中仅显示了具有显着差异表达的基因。重要的基因在该图中用黑色箭头和基因名称标记。

图2 层次聚类分析的热图。左列代表野生型对照,右列代表ABCG1敲除组。每行代表一个基因。从红色到蓝色的颜色变化代表lg(FPKM+1)值,范围从高到低。具有相同或相似表达模式的基因用黑线链接。

3   GO分析

确定了7个显着丰富的GO项(表4和图3),其中3个与分子功能有关,4个与生物过程有关。分子功能类别包括GTP结合,鸟苷酸核苷酸结合和鸟苷核糖核苷酸结合。生物过程类别包括免疫系统过程,免疫应答,小GTPase介导的信号转导和细胞内信号转导。(注:GO富集的相关通路)

图3.富集的GO路径的散点图。横轴表示富集的GO路径。纵轴代表每个GO途径的富集因子。富集因子是指在某些GO途径中富集的DEG数量与注释基因数量之比。值越大,DEGs富集度越高。点的大小表示在特定途径中富集的DEG的数量,并且点的颜色对应于q值(调整后的p值)的范围。

 

 

4 KEGG分析

鉴定出19个显着丰富的KEGG途径(表5和图4)。这些途径涉及脂肪酸的生物合成和代谢,MAPK信号传导途径,抗原加工和呈递,病毒感染和免疫反应。还包括与免疫系统疾病(例如1型糖尿病,自身免疫性甲状腺疾病和原发性免疫缺陷)相关的途径。(注:KEGG富集的相关通路)

图4 丰富的KEGG途径的散点图。水平轴代表丰富的KEGG途径。纵轴代表每个KEGG途径的富集因子。富集因子是指在某些KEGG途径中富集的DEG数量与注释基因数量之比。值越大,DEGs富集度越高。点的大小表示在特定途径中富集的DEG的数量,并且点的颜色对应于q值(调整后的p值)的范围。

 

 

5  通过实时定量PCR验证RNA-seq结果

我们通过实时PCR验证了与动脉粥样硬化发展有关的十个个体基因的mRNA水平。这十个基因参与脂质代谢,白细胞跨内皮迁移,细胞粘附,细胞凋亡和吞噬作用。与野生型相比,在ABCG1-/-小鼠中ABCA1,ApoA-4,Sdc4,Vps37b和Hspa2上调,而ApoB,ApoA-1,JAM-1,Fas和CXCR6下调(图5)。基因表达的变化与从RNA-seq分析获得的结果一致。(注:qPCR验证差异基因的表达量变化)

讨论

 

 

讨论部分作者详细描述了ABCG1敲除后的差异基因和富集的通路的相关研究结果。


AnalysisofdifferentialgeneexpressionbyRNA-seqdatainABCG1knockoutmice

通过RNA-seq数据分析ABCG1基因敲除小鼠中的差异基因表达

期刊:Gene  影响因子:2.638

发表单位:协和医院和中国医学科学院 

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2019-11-13
RNA-seq数据分析文献2 - 基因敲除 -RNAseq
除去准备实验模型不算,本篇是一个RNAseq实验,写了一篇文章。思路:实验处理--RNA-seq和差异基因分析--差异基因富集分析;图表:研究背景和实验处理图、火山图、热图、GO富集结果、GO散点图;差异基因表,附加材料为实验处理图,RNA-seq定量结果表。 摘要 本篇文章中,作者主要通过将GRL敲除后斑马鱼的RNA-seq数据研究目的基因的通路和下游基因。 前言 本部分作者阐述了研究基因和动物材料相关的内容。 方法 动物材料和预处理 本部分作者详细介绍了研究所用的动物材料和CRISPR/Cas9敲除的...[详细]
2019-11-13
RNAseq纯测序分析文章整理说明
近几年,RNAseq测序价格极大降低,许多老师大量的做RNAseq。RNAseq是对样品中的totalRNA提取并进行高通量测序,通过分析获得各类分子的表达量。通过对照组与处理组等比较得到差异表达的基因,并对差异基因进行如GO/KEGG富集,了解处理因素影响的生物学过程、通路等。 RNAseq是RNA分子测序的总称,常见的有mRNA测序,miRNA测序,lncRNA测序,circRNA测序,也可以全部测序,称为全转录组测序。 这几类测序都需要先获得样品的totalRNA,根据所需要分子的不同。可以对各类分...[详细]
2019-11-12
  • RNA-seq数据分析文献18-RNAseq纯分析-3.634​
    导读 思路:实验处理(压力+睡眠剥夺PSD)--RNA-seq和差异基因分析--GO富集分析和互作网络分析;图表:实验处理流程图、热图、Venn图、GO富集图、互作网络图;附加材料为RNA-seq定量结果表,GO富集结果表。 摘要 本部分主要为背景和结果的概述。 前言 背景部分主要介绍了垂体调节睡眠的相关背景。 方法 RNA提取和纯化 整个垂体样品(n=3-4/组)在室温下用装有22号规的1-mL无菌注射器在500LRiboZol(AMRESCORiboZolRNA提取试剂,VWR,Radnor,PA,美...
  • RNA-seq数据分析文献8
    导读 思路:公共数据收集--蛋白质-RNA互作模型分析及验证--motif分析。图表:常规柱形图、散点图、箱线图、热图、韦恩图等统计图;motif图等。 摘要 通过剪接、转运、翻译和降解,基因表达的转录后水平受到严格调控。RNA结合蛋白(RBP)在转录后基因调控中起关键作用,RBP-RNA相互作用的遗传变异影响基因产物和功能。本篇研究开发了一种计算方法,ASPRIN(等位基因特异性蛋白质-RNA相互作用),通过CLIP-seq和RNA-seq数据的联合分析,观测CLIP-seq中RBP等位基因偏好(与RN...
  • RNA-seq数据分析文献23-基因敲除RNAseq-qPCR
    导读 思路:基因敲除--RNA-seq与差异基因分析--差异基因功能富集;图表:差异基因火山图、热图、功能富集气泡图;qRCR引物表、RNA质控数据表、差异基因表、GO和KEGG通路富集表; 摘要 本文是一篇基因敲除小鼠的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究ABCG1基因的功能及其下游基因和通路。摘要部分作者从目的、方法、结果、结论四个方面对该研究做了简述。 前言 背景部分作者介绍了关于胆固醇代谢与动脉粥样硬化,ABCG1的已研究的功能等相关内容。 方法 动物和饮食 、 PBMC...
  • RNA-seq数据分析文献21-公共数据WGCNA分析-5.515
    Comprehensivetranscriptomicanalysisindicatesbrainregionalspecificalterationsintype2diabetes 全面的转录组分析表明2型糖尿病的大脑区域特异性改变 期刊:Aging(AlbanyNY)影响因子:5.515发表单位:北京大学健康科学中心基础医学院 导读 思路:GTEx数据收集--差异表达基因分析,GO、KEGG功能富集分析--基因共表达分析,网络特征、T2D相关模块及中枢基因的识别。图表:统计类如柱形图、提琴图、散点图,...
  • RNA-seq数据分析文献2 - 基因敲除 -RNAseq
    除去准备实验模型不算,本篇是一个RNAseq实验,写了一篇文章。思路:实验处理--RNA-seq和差异基因分析--差异基因富集分析;图表:研究背景和实验处理图、火山图、热图、GO富集结果、GO散点图;差异基因表,附加材料为实验处理图,RNA-seq定量结果表。 摘要 本篇文章中,作者主要通过将GRL敲除后斑马鱼的RNA-seq数据研究目的基因的通路和下游基因。 前言 本部分作者阐述了研究基因和动物材料相关的内容。 方法 动物材料和预处理 本部分作者详细介绍了研究所用的动物材料和CRISPR/Cas9敲除的...
  • RNA-seq数据分析文献22-差异基因与临床数据相关性分析
    导读 思路:实验处理--RNA-seq和差异基因分析--qPCR和免疫染色验证;图表:实验处理图、热图、实验验证图;差异基因表、差异基因相关性分析表,附加材料为RNA-seq定量结果表、GO富集结果表。 摘要 本文是一篇人牙周样品的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究吸烟对牙周膜基因表达量的差异。摘要部分作者以背景、方法、结果、结论四个方面对该研究做了简述。 前言 背景部分介绍了吸烟对牙周膜的有害影响的研究背景,指出其通路机制尚未清楚。 方法 研究设计和研究人群 招募了牙周和全身...
  • RNA-seq数据分析文献17 - siRNA - RNA-seq
    导读 思路:实验处理(干扰RNA)和实验验证--RNA-seq和差异基因分析--功能富集分析--验证下游基因; 图表:实验处理图、火山图、PCA图、通路富集图、Venn图、qPCR结果图、实验验证图;附加材料为差异基因表和实验验证图。 摘要 摘要部分作者根据之前的研究发现JAK1基因的重要作用,介绍本研究的主要内容。 前言 背景部分作者介绍了未折叠的蛋白质反应(UPR)的研究背景和JAK家族的功能。 方法 RNA测序和生物信息学 通过Qubit荧光计定量RNA。 通过BioanalyzerNano芯片评估...
  • RNA-seq数据分析文献29 - 狗前列腺RNAseq-4.011
    导读 思路:实验前处理--RNA-seq与差异基因分析--通路富集分析;图表:RNA-seq质控图、Venn图、PCA图、差异基因热图;实验对象信息表; 摘要 本文是一篇犬前列腺癌样品的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究超声引导下细针穿刺活检的检测能力。 前言 背景部分介绍了犬前列腺癌的传统检测方法和本研究的目的。 结果 1 实验对象 本部分介绍了本实验的实验对象和检测结果。 2 RNA数量 在来自41只狗的42个US-FNA样本,来自31只狗的31个PM-FNA吸出物和来自4...
  • RNA-seq数据分析文献25-RNAseq+蛋白组学-4.183
    导读 思路:细胞系溶菌酶处理--RNA-seq与差异基因分析--功能富集--蛋白组学分析;图表:实验流程图、差异基因功能图、火山图、热图、基因富集图、互作分析图;差异基因表、基因功能富集表、蛋白质组学定量结果表; 摘要 本文是一篇单核细胞系样品的RNA-seq数据分析文章,作者希望从RNA-seq数据中研究溶菌酶对单核细胞基因表达量的差异。 摘要部分介绍了溶菌酶的功能和实验流程。 前言 背景部分作者介绍了溶菌酶的生物学功能和临床应用,指出其与免疫细胞互作的分子机制尚未发现。 结果 在用溶菌酶处理1小时结束...
  • RNA-seq数据分析文献6 - TCGA数据分析
    导读 思路:公共数据收集--RNA-seq和差异基因分析--互作网络分析及模型构建。 图表:常规柱形图、散点图、箱线图、森林图等统计图;相关图、互作网络图、基因表达热图、生存曲线图等。 摘要 背景: 尿道膀胱癌(BLCA)是世界范围内最常见的预后不良的恶性肿瘤之一。 这项研究旨在探索有效的预后生物标志物,并建立BLCA患者的预后风险评分模型。 方法: 基于从癌症基因组图谱数据库中检索到的RNA-Seq数据,通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)确定与BLCA病理阶段相关的共表达模块。 通过Cox比例风险...