2019-10-24 18:02:29 热度:

小鼠口腔菌群促使口腔鳞状细胞癌(OSCC)的恶化

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤。根据16SrRNA基因测序和宏转录组学分析,我们研究了在4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)诱导的OSCC模型小鼠中,口腔菌群组成及其功能的变化特征。

 

与健康小鼠相比,肿瘤组小鼠口腔菌群多样性总体增加。Parabacteroides丰度在健康小鼠中低于肿瘤组,Corynebacterium的结果与之相反。宏转录组学分析结果揭示了菌群中一些相关代谢通路的过表达,表明口腔细菌的某些特定生理活动对OSCC的发生和发展至关重要。

 

 

材料与方法

实验设计

采用4-NQO诱发无菌小鼠口腔鳞状细胞癌(OSCC),并接种不同来源的口腔菌群。无菌小鼠共分为以下4组(每组n=8):

第1组(无4-NQO诱导,接种来自OSCC肿瘤小鼠的口腔菌群);

第2组(4-NQO诱导的无菌小鼠);

第3组(4-NQO诱导,接种来自健康小鼠的口腔菌群);

第4组(4-NQO诱导,接种来自OSCC肿瘤小鼠的口腔菌群)。

造模后观察小鼠病理性变化。在第1、3、9、18、26周采集实验小鼠口腔拭子样本,进行16SrRNA基因测序研究;并于实验结束时(第26周),进行宏转录组分析。

 

造模方式

在小鼠饮用水中添加50ppm4-NQO,持续16周,然后停止4-NQO处理,正常养殖至26周。

 

口腔菌群的接种方式

用棉签在健康小鼠及先前实验已形成OSCC肿瘤的小鼠舌部摩擦,重悬于唾液培养基,并在实验开始时口服饲喂给实验小鼠。

 

测序区域及平台

IlluminaMiSeq 16SV3-V4区段扩增子测序

Illumina NextSeq500宏转录组测序

 

 

研究成果

1、定植菌群增加小鼠的肿瘤发生几率

我们用4-NQO诱导的无菌小鼠口腔鳞状细胞癌(OSCC)模型来确定口腔微生物组对肿瘤发生的影响(图1a)。4-NQO持续诱导16周的小鼠发生病理学变化,其中第2组发生癌前病变,3、4组诱发了OSCC肿瘤,而未经4-NQO诱导的小鼠没有恶性病理学情况发生(第1组)。

 

4-NQO诱导、并有来自健康(第3组)或OSCC肿瘤小鼠(第4组)的口腔微生物定植的小鼠,比4-NQO诱导的无菌小鼠(第2组),有更多的OSCC肿瘤数目(图1b)。相应的,4-NQO诱导的无菌小鼠(第2组)虽然也均表现出癌前病变,但在26周的实验期间,未完全发展为OSCC。4-NQO诱导的小鼠中,第3组比第4组具有更多和更大的肿瘤(图1b、c)。

 

这些结果表明,口腔里一些特定微生物的存在促进了致癌物诱导的OSCC的发展。我们还观察到,4-NQO诱导小鼠中,宿主免疫细胞(包括CD8细胞毒性T细胞,CD4辅助性T细胞和Ly6G髓样细胞)浸润到皮下区域的情况有所增加(图1d)。

 

图1.4-NQO在小鼠中诱发口腔鳞状细胞癌(OSCC)。(a)26周代表性舌部图;(b)实验设计、小鼠数量、以及肿瘤数量统计。MBa,接种OSCC肿瘤小鼠的微生物组;MBb,接种健康小鼠的微生物组。(c)不同实验组的平均肿瘤大小。(d)OSCC和不典型增生的病变部位的细胞浸润。

 

2、与肿瘤发生相关的菌群特征

小鼠在3周后显示出微生物多样性的增加,随后多样性显著降低,与移植菌群无关(图2a和b)。9周后,接种健康小鼠口腔菌群、并经4-NQO处理组(第3组),始终比其他两组具有更高的多样性(图2a)。β多样性分析表明,1、3、4组中大约40%的共有物种(图2c)。但3周后共有物种数量减少(图2d),表明随着生理情况的变化,各组小鼠的菌群差异逐渐增大。

 

图2.不同微生物群落多样性的变化。(a)实验后各周的比较。(b)各实验组的概况。(c)β多样性的箱线图,各实验组进行比较。(d)β多样性的箱线图,各周的比较。

 

图3.NMDS图。基于Brian-Curtis距离排序。

 

图4.LEfSe分析结果表明,细菌在OSCC和健康对照之间发生了变化。(a)第18周,第1组与第3组;(b)第18周,第1组与第4组;(c)第26周,第1组与第3组;(d)第26周,第1组与第4组。

 

3、16SrRNA基因测序分析与肿瘤发生显著相关的细菌种类

研究结果显示,肿瘤发生过程中,与OSCC相关的两属细菌Parabacteroides和Corynebacterium,在不同组间呈现不同变化趋势。实验初始,未经4-NQO处理的小鼠(第1组)有高百分比的副杆状菌属(Parabacteroides)和低百分比的棒状杆菌属(Corynebacterium)。9周以后,副杆状菌属丰度降低,棒状杆菌属丰度增加(图5a)。接种OSCC肿瘤小鼠菌群的第4组中,这两属与第1组呈现完全相反的趋势(图5c)。接种健康菌群的小鼠(第3组),则无明显趋势变化(图5b)。

 

图5.实验过程中不同属细菌的相对丰度轨迹。随时间推移(x轴)、最常见细菌属的相对丰度(y轴),阴影区域表示95%的置信区间。(a)第1组;(b)第3组;(c)第4组。

 

4、宏转录组测序显示各组总体菌群存在差异,活跃菌群相似

在实验结束时的第26周,分析各组小鼠菌群的宏转录组状况。对宏转录组测序得到的基因表达数据进行PCA分析时,观察到三组总体菌群有明显的分离,第4组的两个样品间差异也较大(图6a和b)。LEfSe分析表明Pasteurellales和Rodentibacter始终具有很高的活性(图6c和d)。

 

图6.(a)基于活跃菌群的PCA图。(b)基于原始菌群的PCA图。(c)第1组(绿色)和第3组(红色)的LEfSe分析。(d)第1组(绿色)和第4组(紫色)的LEfSe分析。

 

5、功能活性与总体菌群组成无关

比较对照组(第1组)与接种了致瘤菌群的第3、4组的宏转录组表达谱。确定了未经4-NQO处理的对照组与第3组之间的3,243个差异表达(DE)基因,以及对照组与第4组之间的1,892个DE基因。

 

分析鉴定出了一个与OSCC相关的DE核心基因簇,而该基因簇与各组个体的菌群组成并不显著相关。GO富集分析显示,致瘤微生物组中的功能活性与总体菌群组成无关。同时观察到,与非致瘤微生物组相比,与N-乙酰神经氨酸分解代谢相关的活性、规范Wnt信号通路相关的活性、肌动蛋白丝解聚相关的活性均增加(图7)。

 

图7.小鼠口腔菌群宏转录组的GO富集分析。气泡颜色表示P值(深红色的值接近0)。

 

使用HUMAnN2,进行对照组与肿瘤组之间的差异功能丰度分析,该结果基于MetaCyc数据库。与GO结果一致,大部分富集途径在OSCC接种组中,无论总体菌群组成如何,3、4组中的大部分途径都是相同的。根据该数据库,发现OSCC接种组主要富集在氨基酸的生物合成、脂质生物合成,核苷酸生物合成以及能量途径的产生等(图8)。

 

图8. LEfSe分析展示的宏转录组中的差异功能。(a)第1组与第3组;(b)第1组与第4组。

 

 

研究结论

 

1、接种来自健康或口腔鳞状细胞癌(OSCC)小鼠的口腔菌群,均会加剧/恶化致癌物(4-NQO)诱发OSCC(造模)小鼠肿瘤的发生发展。

2、OSCC造模小鼠口腔微生物多样性较未造模小鼠显著增加,且Parabacteroides和Corynebacterium与OSCC的发生发展密切相关。

3、宏转录组分析显示,各组总体菌群存在差异,活跃菌群与其功能活性相似,并揭示了OSCC相关的代谢谱,包括N-乙酰神经氨酸分解代谢、Wnt信号通路调节、氨基酸及脂质生物合成相关基因的过表达等。

 

 

 

亮点

在致癌物诱导的肿瘤小鼠模型中,研究了小鼠口腔菌群在加剧OSCC中的因果作用。

文献ID

题目:TheOralMouseMicrobiomePromotesTumorigenesisinOralSquamousCellCarcinoma

译文:小鼠口腔菌群促进口腔鳞状细胞癌的发生

期刊:mSystems  IF:6.519

发表时间:2019-08-06

通讯作者:JorgeFrias-Lopeze

通讯单位:佛罗里达大学

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小鼠口腔菌群口腔鳞状细胞癌OSCC恶化

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